任風梅，劉珍紅，李玉軍

（1 青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院病理科，山東 青島 266019； 2 即墨市中醫(yī)醫(yī)院特檢科； 3 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科）

近幾年來，盡管惡性腫瘤的治療取得很大的進展，但對胰腺癌仍缺乏有效治療手段，病人生存率未見明顯提高。大部分病人確診時往往已有轉移，屬臨床晚期，心理恐懼和軀體疼痛必然導致機體處于應激狀態(tài)，使體內腎上腺素和去甲腎上腺素水平增高。本實驗旨在建立裸鼠胰腺癌束縛應激模型，模擬人類應激狀態(tài)，通過檢測移植瘤組織中細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（EMMPRIN）、細胞增殖相關抗原（Ki－67）、血管內皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）和內皮細胞增殖相關抗原（CD105）的表達情況，探討應激促進裸鼠胰腺癌移植瘤生長的機制，為胰腺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取雄性 BALB／C（nu／nu）裸鼠20只，4～6周齡，體質量為15～18 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；人胰腺癌細胞株panc－1由中國協(xié)和醫(yī)院微生物實驗室提供。檢測所需VEGF抗體、CD105抗體、EMMPRIN抗體、Ki－67抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 以含體積分數(shù)0.75乙醇的棉球消毒裸鼠皮膚，將（1～2）×107的人胰腺癌細胞株panc－1單細胞懸液（0.3 mL）接種于裸鼠右肩背部皮下，建立皮下移植瘤模型。隨機分為荷瘤＋應激組和單純荷瘤組。荷瘤＋應激組裸鼠束縛于自制束縛筒中，裸鼠在其中僅為活動受限，束縛筒對軀體及尾部均無壓迫，具體的實驗方法參照文獻［1］。單純荷瘤組正常喂養(yǎng)，不做處理。

1.2.2 觀察指標及檢測方法 觀察各組裸鼠生長狀態(tài)，處死前測量體質量并采血，－20℃保存?zhèn)溆?。裸鼠處死后分別取出腫瘤瘤體，剝離干凈后，以濾紙拭凈血污，電子天平稱取瘤質量。計算腫瘤體積［2］及腫瘤生長率［3］。采用ELISA法檢測裸鼠血清腎上腺素的含量。采用PV－6000法檢測裸鼠移植瘤組織中 EMMPRIN、Ki－67、VEGF、MVD 和 CD105的表達。MVD計數(shù)參照文獻［1］的方法，即于低倍鏡下觀察CD105染色陽性的血管，選取腫瘤MVD最高區(qū)域，然后在高倍鏡下（200倍）選取5個不重復視野分別進行計數(shù)，求其平均數(shù)即作為該標本的MVD值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用PPMS 1.5統(tǒng)計軟件［4］進行統(tǒng)計分析，實驗結果以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 兩組裸鼠體質量、移植瘤情況比較

實驗前兩組裸鼠體質量比較，差異無顯著性（P＞0.05），單純荷瘤組實驗后體質量明顯大于荷瘤＋應激組，差異有顯著性（t＝2.713，P＜0.05）。與單純荷瘤組裸鼠相比較，荷瘤＋應激組腫瘤體積明顯增大（t＝－2.486，P＜0.05）、瘤質量明顯增加（t＝－2.685，P＜0.05）。見表1。荷瘤＋應激組腫瘤生長率為51.04%。

表1 慢性束縛應激對裸鼠體質量及移植瘤的影響（±s）

表1 慢性束縛應激對裸鼠體質量及移植瘤的影響（±s）

組 別 n 實驗前體質量（m／g） 實驗后體質量（m／g） 腫瘤體積（V／mm3） 瘤質量（m／g）單 純 荷 瘤 組 10 15.76±2.07 21.78±1.40 190.48±160.70 0.96±0.41荷瘤＋應激組 10 15.67±2.22 20.26±1.10 387.87±192.90 1.45±0.42

2.2 血清腎上腺素含量

荷瘤＋應激組、單純荷瘤組裸鼠血清腎上腺素含量分別為（75.68±23.98）、（52.97±8.76）μg／L，兩組比較差異有顯著性（t＝－2.812，P＜0.05）。

2.3 免疫組織化學染色檢測

荷瘤＋應激組裸鼠移植瘤組織中EMMPRIN、Ki－67和VEGF的陽性表達均明顯高于單純荷瘤組，差異均有顯著意義（Z＝－2.636～－2.033，P＜0.05）。荷瘤＋應激組MVD平均值為23.58±2.93，單純荷瘤組MVD平均值為20.64±1.44，兩組比較差異有顯著性（t＝－2.846，P＜0.05）。見表2。

表2 兩組裸鼠移植瘤組織中EMMPRIN、Ki－67、VEGF的表達（只）

2.4 各指標的相關性

移植瘤組織中VEGF的表達與MVD呈正相關（r＝0.475，P＜0.05）；EMMPRIN 與 VEGF及Ki－67的表達呈正相關（r＝0.702、0.534，P＜0.05）。

3 討 論

3.1 人胰腺癌荷瘤裸鼠束縛應激模型的建立

本實驗在應激過程中不壓擠動物，動物可以前后活動并不感到疼痛，僅僅是心理感到限制束縛，因此在很大程度上動物處于心理應激，從而基本控制了生理應激對裸鼠影響。雖然心理應激反應因應激原種類、動物種屬、性別、生理狀態(tài)、應激狀態(tài)的不同而有所差異，但血清兒茶酚胺和糖皮質激素含量升高被視為應激反應的標志。本文結果顯示，荷瘤＋應激組血清腎上腺素含量明顯高于單純荷瘤組，說明人胰腺癌荷瘤裸鼠不良心理應激模型建立成功。

3.2 應激與腫瘤細胞增殖的關系

Ki－67是一種細胞核增殖相關抗原，可反映腫瘤的增殖速度。近來的研究顯示，Ki－67在人類乳癌、血液腫瘤等多種惡性腫瘤中均過度表達［5］。本實驗荷瘤＋應激組移植瘤組織中Ki－67的陽性表達顯著高于單純荷瘤組，說明束縛應激增強了胰腺癌細胞的增殖活性，促進了腫瘤的生長。原因可能是束縛應激時機體內分泌激素水平發(fā)生變化，交感神經和腎上腺釋放的兒茶酚胺類物質于腫瘤微環(huán)境中，可刺激腫瘤細胞的增殖，可能同時也會提高腫瘤細胞的轉移能力和促血管生成能力。

3.3 應激與腫瘤微血管生成的關系

VEGF又稱血管通透因子（VPF），與細胞上的相應受體VEGFR結合而發(fā)揮作用［6］，具有誘導血管生成及抑制細胞凋亡等多種功能 。CD105可以選擇性地表達在處于增殖狀態(tài)的血管，比常規(guī)標記血管的指標如CD34更能說明血管生成的情況。本實驗結果顯示，荷瘤＋應激組移植瘤組織中VEGF的陽性表達和MVD顯著高于單純荷瘤組，而且移植瘤組織中VEGF的表達與MVD呈明顯的正相關。實驗結果提示應激可能通過上調移植瘤組織中VEGF的表達，而促進腫瘤微血管的生成。一方面隨著腫瘤迅速生長，腫瘤組織內部低氧，由于荷瘤＋應激組裸鼠移植瘤生長較單純荷瘤組迅速且瘤體積較大，所以移植瘤組織內部低氧更嚴重一些，低氧誘導因子－1誘導了腫瘤細胞VEGF的表達［7］。另一方面，由于荷瘤＋應激裸鼠體內兒茶酚胺類物質水平升高，其中腎上腺素可以與其受體相結合，從而激活c A MP－蛋白激酶A信號傳導通路，誘導腫瘤細胞VEGF的表達。

3.4 應激與腫瘤組織中EMMPRIN的關系

EMMPRIN可作用于鄰近的腫瘤細胞以及間質中的成纖維細胞，分泌基質金屬蛋白酶（MMPs），降解基底膜，水解腫瘤細胞表面的黏附成分，降低細胞間的黏附性，而有助于癌細胞的遷移［8］。本實驗結果顯示，荷瘤＋應激組移植瘤組織中EMMPRIN的陽性表達顯著高于單純荷瘤組，提示應激能刺激腫瘤細胞產生分泌EMMPRIN蛋白，導致其活性升高，并導致可溶性的EMMPRIN蛋白的釋放，進而又可通過旁分泌途徑促進鄰近的成纖維細胞產生MMPs和EMMPRIN，形成正反饋的調節(jié)機制，促進腫瘤的浸潤和轉移。

3.5 移植瘤組織中EMMPRIN和Ki－67、VEGF表達的相關性

本文的實驗結果顯示，裸鼠胰腺癌移植瘤組織中EMMPRIN與Ki－67、VEGF的表達均呈正相關，提示EMMPRIN高表達可以促進腫瘤細胞增殖和血管的生成。EMMPRIN提高腫瘤細胞增殖能力的確切機制目前仍不是很清楚。其可能機制如下：①EMMPRIN誘導成纖維細胞產生的MMPs能夠降解細胞外基質，導致潛伏在細胞外空間的生長因子釋放，從而促進腫瘤的生長［9－10］；②EMMPRIN 通過增加透明質烷的水平來誘導腫瘤細胞錨著非依賴性生長［11］；③EMMPRIN還可以通過減少促進凋亡蛋白的聚集來保護細胞免于失巢凋亡［12］。

總之，本文研究結果提示，應激狀態(tài)促進裸鼠胰腺癌細胞生長機制可能是通過激活神經內分泌信號傳導通路，上調EMMPRIN和VEGF的表達，誘導腫瘤細胞增殖和血管生成而實現(xiàn)的。本實驗結果為胰腺癌的治療提供了新的思路。

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