王清，葛瑩，宋廣輝，趙素芝

（1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 青島 266100； 2 山東省煤炭泰山療養(yǎng)院內(nèi)二科）

血清胱抑素C（Cys C）作為一種新的反映腎小球?yàn)V過率（GFR）的內(nèi)源性標(biāo)志物，為判斷腫瘤、肝硬化、腎衰竭等疾病中GFR的變化提供了快速、精確而又簡(jiǎn)單的方法。有人已經(jīng)原核表達(dá)了Cys C，由于融合蛋白以包涵體形式存在，包涵體蛋白的復(fù)性和純化過程非常復(fù)雜，而且由于原核生物密碼子的偏性，導(dǎo)致了真核基因在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)率較低［1］。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種適宜表達(dá)外源基因的真核表達(dá)系統(tǒng)，得到了廣泛的應(yīng)用［2］。本研究利用該表達(dá)系統(tǒng)，使Cys C基因在巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）中表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了免疫原性分析。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 P.pastoris GS115（His－，Mut＋）和質(zhì)粒p PIC9k由本室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶（Takara生物技術(shù)有限公司），蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（上海拜力生物科技有限公司），G418、生物素、酵母氮源（YNB）和硝酸纖維素膜（上海生工生物工程有限公司），顆粒增強(qiáng)透射免疫比濁法（PETIA）CysC檢測(cè)試劑盒（北京利德曼生物技術(shù)有限公司），Bio－Rad Gene Pulser電轉(zhuǎn)化儀、CysC蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（新城生物科技股份有限公司），鼠抗人CysC單克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）。

1.1.3 培養(yǎng)液 YEPD：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，p H 6.0，115℃濕熱滅菌20 min。MD：13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，20 g／L葡萄糖，15 g／L瓊脂。BMGY：2 g／L蛋白胨，1 g／L酵母提取物，100 mmol／L磷酸鉀緩沖液（p H 6.0），13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，1 g／L甘油。BMMY：將 BMGY 中的1 g／L甘油替換為5 g／L甲醇。MM：13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，5 g／L甲醇。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建攜帶合成Cys C基因的重組表達(dá)載體p PIC9k－Cys C 根據(jù) Cys C的 mRNA 序列（Gen－Bank公布）進(jìn)行分析，按照P.pastoris GS115（His－，Mut＋）表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好［3］，優(yōu)化基因序列，檢查基因內(nèi)部有無(wú)特別復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列；用P.pastoris GS115（His－，Mut＋）偏愛的密碼子替代野生型Cys C基因序列中的酵母稀有密碼子，調(diào)整GC含量，消除富含AT的序列區(qū)段，避免翻譯的提前終止，并且避免可能影響mRNA穩(wěn)定性的連續(xù)5個(gè)或5個(gè)以上的A／T或G／C重復(fù)序列。合成Cys C基因經(jīng)同義密碼子修改以后，所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列并未發(fā)生變化。根據(jù)基因序列的分析結(jié)果，人工合成Cys C，連接至目的載體p PIC9k，構(gòu)建p PIC9k－Cys C并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5中，測(cè)序，驗(yàn)證重組克隆中基因序列是否與要求相符。

1.2.2 轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115 將5～20μg質(zhì)粒DNA用SalⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化GS115細(xì)胞（參數(shù)：電壓1.5 k V，電容25μF，電阻200Ω），電擊時(shí)間4～10 ms，His＋轉(zhuǎn)化子接種到無(wú)組氨酸的MD平板上，30℃培養(yǎng)3～4 d。然后，PCR分析目的基因是否整合到基因組中。設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增插入片段的引 物，引物序列如下：5′AOX1－F，5′－GACTGGTTCCAATTGACAAGC－3′；3′AOX1－R，5′－GCAAATGGCATTCTGACATCC－3′。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的多拷貝整合篩選根據(jù)p PIC9k中的表達(dá)手冊(cè)（Invitr ogen公司）篩選多拷貝整合菌株。將轉(zhuǎn)化菌落分別點(diǎn)在G418濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0 g／L的 YEPD培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)3～4 d，篩選多拷貝整合菌株。然后將高拷貝的重組子分別對(duì)應(yīng)點(diǎn)于MM和MD培養(yǎng)板上，篩選His＋Mut＋陽(yáng)性克隆。

1.2.4 Cys C的誘導(dǎo)表達(dá) 將G418篩選出的高拷貝轉(zhuǎn)化子3株分別接種于100 mL BMGY增菌培養(yǎng)液中，28～30℃、280 r／min振蕩過夜至A600為3～6。3 000 r／min離心5 min收集細(xì)胞，在4℃下將細(xì)胞沉淀物重新懸浮在500 mL含10 g／L酪氨酸BMMY（p H 6.0）培養(yǎng)液中，使懸浮液A600＝1。每24 h加10 g／L甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)5 d，收獲的時(shí)間間隔為0、24、48、72、96和120 h，用 PETIA Cys C檢測(cè)試劑盒確定最佳收獲時(shí)間?？蛰d體p PIC9k轉(zhuǎn)化子作為陰性對(duì)照，在相同條件下被誘導(dǎo)。

1.2.5 SDS－PAGE和 Wester n blot分析 取30 μL培養(yǎng)物上清液在120 g／L SDS－PAGE上電泳，考馬斯亮藍(lán)R－250染色。通過SDS－PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用鼠抗人Cys C單克隆抗體（1∶1 000稀釋）孵育，并用小鼠抗兔Ig G（1∶4 000稀釋）與辣根過氧化物酶（HRP）耦聯(lián)。洗膜，用四甲基聯(lián)苯胺（T MB）反應(yīng)10 min。

1.2.6 動(dòng)物免疫及血清抗體檢測(cè) 將Bal b／c小鼠隨機(jī)分為A組和PBS組，每組12只。A組每只小鼠皮下注射50μg純化的酵母表達(dá)重組蛋白和等體積完全弗氏佐劑，PBS組注射PBS和等體積完全弗氏佐劑。首次免疫后14 d加強(qiáng)免疫1次，7 d后再免疫1次，追加免疫用不完全弗氏佐劑，共免疫3次。眶靜脈取血，4℃放置分離血清，－20℃凍存?zhèn)溆?。?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品Cys C蛋白作為抗原間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中抗Ig G抗體。

1.2.7 Cys C定量測(cè)定 用PETIA Cys C檢測(cè)試劑盒確定最佳收獲時(shí)間。取各個(gè)時(shí)間間隔少量培養(yǎng)液，離心后用日立全自動(dòng)生化分析儀PETIA Cys C試劑盒測(cè)定Cys C濃度，嚴(yán)格按說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 優(yōu)化后的Cys C基因

120個(gè)氨基酸密碼子中有77個(gè)進(jìn)行了優(yōu)化，消除避免可能影響mRNA穩(wěn)定性的連續(xù)5個(gè)或5個(gè)以上的A／T或G／C重復(fù)序列9處，中止子由TAG轉(zhuǎn)換為TAA。優(yōu)化基因序列后GC含量由原來的60.8%降低到37.7%。合成的基因使用同義的密碼子而氨基酸序列沒有變化。所設(shè)計(jì)的合成Cys C基因與野生型Cys C基因序列對(duì)比見表1。

表1 合成CysC基因與野生型CysC基因序列對(duì)比

2.2 重組質(zhì)粒p PIC9k－Cys C的鑒定

以少量堿裂解法快速提取的重組質(zhì)粒p PIC9k－Cys C，經(jīng)Eco RⅠ及NotⅠ雙酶切及DNA序列分析顯示，重組質(zhì)粒p PIC9k－Cys C符合設(shè)計(jì)要求，重組克隆構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒對(duì)酵母菌的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定

電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母，能產(chǎn)生足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化體。

2.4 SDS－PAGE分析

陽(yáng)性表達(dá)菌在相對(duì)分子質(zhì)量約19 000處有一條帶，空載體陰性對(duì)照菌未見該條帶。表達(dá)水平與拷貝數(shù)呈正比，即高拷貝高表達(dá)，產(chǎn)物約占分泌總蛋白的80%以上（圖1）。

圖1 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析

2.5 Wester n blot測(cè)定

通過SDS－PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，能與相應(yīng)Cys C抗體形成單一蛋白條帶，證明表達(dá)純化的蛋白是Cys C蛋白（圖2）。

2.6 Cys C抗血清效價(jià)和特異性鑒定

ELISA間接法測(cè)定抗血清效價(jià)為1∶8 000；Wester n blot測(cè)定顯示抗血清能與Cys C標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生免疫反應(yīng)。

2.7 Cys C定量測(cè)定

Cys C定量測(cè)定結(jié)果顯示，Cys C高拷貝轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)的最佳收獲時(shí)間為120 h，其上清液濃度達(dá)到600～950 mg／L。

圖2 CysC表達(dá)蛋白鑒定

3 討 論

Cys C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在抗病毒、抑制腫瘤的生長(zhǎng)、預(yù)防食品加工過程中蛋白水解方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。此外，內(nèi)源性Cys C是一種檢測(cè)GFR的新指標(biāo)。雖然已在大腸埃希菌中表達(dá)了Cys C融合蛋白，但該蛋白多以包涵體形式存在，而且由于原核生物密碼子的偏性，導(dǎo)致了大腸埃希菌為宿主菌的原核表達(dá)產(chǎn)物量低［1－4］。

為了高純度、高產(chǎn)量表達(dá)Cys C蛋白，本研究選擇了p PIC9k作為表達(dá)載體，并在P.pastoris GS115中表達(dá)Cys C。因?yàn)樵S多外源蛋白質(zhì)在酵母中表達(dá)，得到類似于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的、結(jié)構(gòu)和生物活性相似的天然的蛋白質(zhì)［5－6］。此外，p PIC9k中的α因子分泌信號(hào)序列，使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。p PIC9k為整合型分泌表達(dá)載體，畢赤酵母His＋轉(zhuǎn)化子高拷貝整合事件自發(fā)發(fā)生的概率為1%～10%，p PIC9k含有細(xì)菌kan基因，賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性。遺傳霉素抗性水平主要依賴整合的kan基因的數(shù)目。單拷貝p PIC9k整合入畢赤酵母基因組后，賦予P.pastoris約0.25 g／L的遺傳霉素抗性水平。任何載體多拷貝整合可增加遺傳霉素抗性水平，從0.5 g／L（1～2拷貝）到4.0 g／L（7～12拷貝）。由于kan基因與表達(dá)盒（p AOX1及目的基因）之間有遺傳連鎖，可從遺傳霉素高抗性推斷該克隆所包含多拷貝目的基因數(shù)［7］。由于基因的劑量效益，蛋白的表達(dá)可能會(huì)增加，拷貝數(shù)越高表達(dá)量也越高［8］。

外源蛋白可在P.pastoris胞內(nèi)表達(dá)或分泌至胞外。分泌表達(dá)需要蛋白上的信號(hào)肽序列，將外源蛋白靶向分泌至胞外。P.pastoris只分泌很少的自身蛋白，加上P.pastoris最小生長(zhǎng)培養(yǎng)基中只有少量的蛋白，這意味著分泌的外源蛋白是培養(yǎng)基中蛋白的主要組成成分，也可算作蛋白純化的第一步。

在P.pastoris中表達(dá)較高的基因往往是采用P.pastoris本身所偏愛的密碼子，研究也表明在所有61個(gè)密碼子中有25個(gè)是P.pastoris偏愛的。趙翔等［9］通過對(duì)P.pastoris的28個(gè)蛋白編碼同義密碼子的使用情況進(jìn)行分析，確定了P.pastoris的19個(gè)高表達(dá)優(yōu)先密碼子。多位學(xué)者通過對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，改良基因，大大提高了異源基因在P.pastoris中的表達(dá)［10－12］。

在以往的研究中，P.pastoris表達(dá)的Cys C基因均使用野生型基因［13］，其密碼子可能不是宿主細(xì)胞進(jìn)行高水平表達(dá)所偏愛的密碼子，因此表達(dá)水平應(yīng)有提升空間。本研究根據(jù)P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)的特性，在氨基酸序列不變的條件下，重新設(shè)計(jì)Cys C基因，去除復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列，調(diào)整GC含量，消除富含AT的序列區(qū)段，避免翻譯的提前終止，并且避免可能影響mRNA穩(wěn)定性的連續(xù)5個(gè)或5個(gè)以上的A／T或G／C重復(fù)序列。在120個(gè)氨基酸密碼子中有77個(gè)進(jìn)行了優(yōu)化，消除避免可能影響mRNA穩(wěn)定性的連續(xù)5個(gè)或5個(gè)以上的A／T或G／C重復(fù)序列9處，終止子由TAG轉(zhuǎn)換為TAA。優(yōu)化基因序列后，GC含量由原來的68.6%降低到43.6%。通過密碼子優(yōu)化，Cys C的表達(dá)水平達(dá)到600～950 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)，雖然其數(shù)值略低于通常高5～10倍的密碼子優(yōu)化的研究結(jié)果［14］，但它仍然高于其他研究結(jié)果［15］。

本研究用P.pastoris表達(dá)重組Cys C的優(yōu)點(diǎn)為：①在酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)需包涵體的變性和復(fù)性處理，也不需融合蛋白的凝血酶切割，誘導(dǎo)表達(dá)后收集培養(yǎng)液上清即可得到活性的Cys C；②表達(dá)量高，雜蛋白很少，表達(dá)量可以達(dá)到克級(jí)，即使不純化，蛋白純度也可達(dá)到80%以上；③根據(jù)酵母密碼子偏好，優(yōu)化Cys C序列，可以進(jìn)一步提高Cys C表達(dá)量?？梢?，根據(jù)P.pastoris密碼子的偏好，將人Cys C基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化和表達(dá)，為外源基因的表達(dá)提供了一種理想的方法。

［1］WANG Q，MEI C，ZHEN H H，et al.Codon preference optimization increases pr okar yotic Cystatin C expression［J］.J Bio med Biotechnol，2012，ID732017，doi：10.1155／2012／732017.

［2］房師松，劉濤，鄧平建，等.抗菌肽D基因在畢赤酵母中的表達(dá)及鑒定［J］.衛(wèi)生研究，2004，33（1）：81－85.

［3］JIANGPING B，DOUGLAS J，SWARTZ L.A gene opti mization strategy that enhances production of f ully f unctional PGlycopr otein in pichia pastoris［J］.PLoS ONE，2011（6）：e22577.

［4］陳婷梅，俸家富，曹炬，等.人胱抑素C的原核表達(dá)純化鑒定及抗血清的制備［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（10）：938－940.

［5］FU X Y，ZHAO W，XIONG A S，et al.High expression of reco mbinant Strept o myces sp.S38 xylanase in Pichia past oris by codon opti mization and analysis of its bioche mical pr operties［J］.Mol Bio Rep，2011，38（8）：4991－4997.

［6］HUANG Y，CHEN Y，MO D，et al.Attenuated secretion of the ther mostable xylanase xynB from Pichia pastoris using synthesized sequences opti mized from the preferred codon usage in yeast［J］.J Microbiol Biotechnol，2012，22（3）：316－325.

［7］SCORER C A，CLARE J J，MCCOMBIE W R，et al.Rapid selection using G418 of high copy nu mber transf or mants of Pichia pastoris for high－level f oreign gene expression［J］.Biotechnology，1994，12（2）：181－184.

［8］CREGG J M，VEDVICK TS，RASCHKE W C.Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris［J］.Biotechnology，1993，11（8）：905－910.

［9］趙翔，霍克克，李育陽(yáng).畢赤酵母的密碼子用法分析［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2000，16（3）：308－311.

［10］LI Z X，HONG G Q，WU Z H，et al.Opti mization of the expression of hepatitis B virus e gene in Pichia pastoris and i mmunological characterization of the product［J］.J Biotechnol，2008，138（6）：1－8.

［11］ZHAO S M，JUN H，CHANG Y Z，et al.High－level expression of an aspergillus niger endo－β－1，4－glucanase in Pichia pastoris through gene codon opti mization and synthesis［J］.J Microbiol Biotechnol，2010，20（3）：467－473.

［12］GAO Z，LI Z，ZHANG Y，HUANG H，et al.High－level expression of the Penicilliu mnotatu m glucose oxidase gene in Pichia pastoris using codonopti mization［J］.Biotechnol Lett，2012，34（3）：507－514.

［13］SINCLAIR G，CHOY F Y M.Synony mous codon usage bias and the expression of hu man glucocerebr osidase in the met hylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.Pr otein Expr Purif，2002，26（1）：96－105.

［14］WOO J H，LIU Y Y，MATHIAS A，et al.Gene opti mization is necessary to express a bivalent anti－h(huán)u man anti－T cell immunotoxin in Pichia pastoris［J］.Pr otein Expr Purif，2002，25（2）：270－282.

［15］OUTCHKOUROY N S，STIEKEMA W J，JONGSMA M A.Opti mization of the expression of equistatin in Pichia past oris［J］.Pr otein Expr Purif，2002，24（1）：18－24.