徐玉生，李星晨，金偉林，馬玉斐，曾冠楠，王培松

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后大量的炎性細胞浸潤和大量炎癥細胞因子的產(chǎn)生是導(dǎo)致脊髓漸進性潰變的主要因素[1]。有學(xué)者[2]報道，SCI后多種細胞因子明顯上調(diào)，其參與并調(diào)節(jié)損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性損傷的病理過程中起著重要作用。研究[2-4]發(fā)現(xiàn)白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)可對SCI脊髓組織中NF-κB表達和巨噬細胞浸潤產(chǎn)生影響，從而減輕炎癥反應(yīng)。實驗[3]證實褪黑素對多種器官損傷后的炎癥反應(yīng)有抑制作用，但對SCI后神經(jīng)細胞周圍炎癥反應(yīng)及修復(fù)的作用尚不明確，特別是對細胞因子IL-10的分泌作用至今未闡明。作者通過觀察SCI后一次性注射人褪黑素制劑，觀察脊髓和血液中IL-10的變化，探索褪黑素誘導(dǎo)內(nèi)源性IL-10的表達對SCI的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康成年雄性SD大鼠108只，體質(zhì)量(220±20)g，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。在通風(fēng)、適宜溫度和濕度的動物室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)1周。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)要求。

1.2主要試劑及儀器Trizol試劑、RT試劑盒(編號：AE101-01)和PCR試劑盒(編號：AP111-12)均購自Transgene公司，引物購自北京博大泰克公司，大鼠IL-10 ELISA試劑盒購自美國RD公司，兔抗鼠IL-10抗體、DAB試劑盒和SP9002免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，褪黑素、DEPC和EB購自美國Sigma公司。PCR GeneAmp System(美國Applied Biosystems公司，型號：2700)，低溫離心機(美國Sigma公司，型號：3K30)，圖像記錄分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific，型號：D-140)，LE ICACM 1900恒冷箱切片機。

1.3動物模型的建立以體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠取俯臥位，固定于操作臺上。術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒鋪巾，取后正中切口，以T12為中心顯露T11～13棘突和椎板，咬除T12節(jié)段椎板，暴露脊髓硬膜。硬膜上方放置一圓形塑料墊片(直徑6 mm)，再采用改良的Allen’s WD法，用預(yù)實驗中確定的致傷質(zhì)量(5 g)的砝碼自距硬膜15 cm的高度沿導(dǎo)管垂直落下，造成大鼠SCI模型。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：打擊后鼠尾出現(xiàn)無規(guī)則的痙攣性擺動、雙下肢呈回縮性撲動，硬膜表面充血水腫。術(shù)畢以生理鹽水沖洗術(shù)野，再次消毒后常規(guī)縫合切口。

1.4動物的分組及干預(yù)采用隨機數(shù)字表法將108只大鼠分為SCI組(A組)、褪黑素治療組(B組)和假手術(shù)組(C組)。A、B 2組按1.3的方法造模，10 min后分別按體質(zhì)量腹腔注射等體積的含體積分?jǐn)?shù)5%乙醇的生理鹽水和褪黑素(100 mg/kg)，對照組僅行椎板切除術(shù)而不損傷脊髓。各組大鼠每日均給予青霉素40萬U腹腔注射預(yù)防感染，A、B 2組術(shù)后給予人工輔助排尿、排便4～5次/d。

1.5BBB運動功能評分分別于術(shù)后第1、2、3、5、7天將大鼠置于評分操作臺上，環(huán)境適應(yīng)后由3位熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)但不知分組者獨立觀察4 min，取平均值作為評分結(jié)果。每時間點每組均隨機選取6只大鼠，評分后處死，取血清和脊髓組織備用。

1.6組織固定、取材及切片制備于術(shù)后第3天時每組中隨機選取6只大鼠，腹腔注射麻醉后行升主動脈灌注(37 ℃的生理鹽水400 mL充分沖洗組織內(nèi)血液)，并以4 ℃ 40 g/L的多聚甲醛進行固定，30 min后取出手術(shù)部位脊髓標(biāo)本，放置于40 g/L的多聚甲醛中室溫保存。用LE ICACM 1900恒冷箱切片機對脊髓組織作橫切面切片(6 μm厚)，載玻片收集組織后，恒溫烘箱烘干進行HE染色及免疫組化SP法染色。

1.7血清中IL-10水平檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清中IL-10的含量。每例樣本取10 μL血清加入每個孔內(nèi)，按試劑盒流程說明進行操作，最終于450 nm波長下測定吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中IL-10的含量。

1.8脊髓中IL-10mRNA表達的RT-PCR檢測

稱取100 mg凍存的脊髓組織，提取總RNA。大鼠IL-10上游引物序列5’-CAGTCAGCCAGACCCACAT-3’，下游引物序列5’-GGCAACCCAAGTAACCCT-3’，擴增產(chǎn)物大小為141 bp 。內(nèi)參GAPDH上游引物序列5’-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3’，下游引物序列5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，擴增產(chǎn)物大小為595 bp。反應(yīng)體系RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。取5 μL擴增產(chǎn)物進行電泳，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，記錄圖像后用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進行分析，以目的基因和內(nèi)參條帶的灰度值的比值表示目的基因的相對表達量。

1.9組織學(xué)觀察及IL-10蛋白表達的檢測HE染色觀察脊髓病理改變；免疫組化按 SP9002試劑盒說明書操作，中性樹脂封片。每個標(biāo)本取同序數(shù)切片6張，兔抗鼠IL-10抗體(按200倍稀釋)為一抗。以PBS代替一抗作為陰性對照，細胞核和(或)胞質(zhì)染成黃褐色或黑色為陽性細胞。每張片計數(shù)高表達區(qū)3個高倍鏡視野中的陽性細胞個數(shù)，最后取算術(shù)平均數(shù)代表該標(biāo)本IL-10蛋白的表達水平。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組大鼠BBB評分、血清中IL-10水平和脊髓組織中IL-10 mRNA及蛋白表達水平的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠的一般情況共108只大鼠，操作過程中A組3只、B組1只因麻醉過深后死亡，A組4只、B組2只造模不成功后踢出實驗，后進行同情況下補充。術(shù)后早期：A 、B 2組大鼠活動及進食明顯減少，C組較術(shù)前未有明顯改變；A、B 2組均出現(xiàn)后肢癱瘓，尿潴留情況。術(shù)后晚期：B、C 2組較A組大鼠活動及進食較好。取脊髓標(biāo)本見A組損傷部位出現(xiàn)潰瘍及大量的無菌性炎癥反應(yīng)；B組炎癥反應(yīng)較輕，未見潰瘍面。

2.2術(shù)后各組各個時間點BBB運動功能評分比較

見表1。

表1 術(shù)后各組各個時間點BBB運動功能評分比較 (n=6)

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

2.3術(shù)后各組各個時間點血清中IL-10含量比較見表2。血清中IL-10水平從高到低依次為B組、A組、C組，且各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，且A、B組術(shù)后第5天達到高峰。

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

2.4術(shù)后各組各個時間點脊髓中IL-10mRNA表達水平比較見表3。脊髓中IL-10 mRNA表達水平各個時間點從高到低依次為B組、A組、C組，且各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，A、B 2組術(shù)后在第5天達到高峰。

2.5脊髓標(biāo)本HE染色和免疫組化染色結(jié)果見圖1。A、B 2組出現(xiàn)脊髓組織血管充血，B組較A組神經(jīng)細胞脫水變化輕，說明褪黑素可以減輕脊髓損傷后病理變化。免疫組化見IL-10在中央管附近的神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞質(zhì)中分布較多，其中中央管室管膜細胞胞質(zhì)中也有較強表達。陽性細胞計數(shù)從多到少依次為B組[(10.6±1.8) 個/HP]、A組[(9.1±1.4) 個/HP]和C組[(4.1±0.5) 個/HP]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=146.281,P<0.001)。各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 術(shù)后各組各個時間點脊髓中IL-10 mRNA表達水平比較 (n=6)

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

圖1 各組大鼠脊髓HE染色和免疫組化染色結(jié)果

3 討論

急性脊髓損傷后脊髓組織主要有缺血、脂質(zhì)過氧化、離子的失衡、炎癥細胞浸潤和炎癥因子的釋放等表現(xiàn)。其中炎癥因子的大量產(chǎn)生和釋放是繼發(fā)性損傷的主要過程。有效地控制SCI后的炎癥反應(yīng)，盡可能地使繼發(fā)性損傷的程度降到最低，是改善預(yù)后的關(guān)鍵所在。

褪黑素是一類主要有松果體細胞分泌的肽類激素，具有調(diào)節(jié)時間節(jié)律、影響神經(jīng)內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)體溫中樞等生理作用，并可減輕中性粒細胞介導(dǎo)的毒性損害作用[5]。研究證實其對脊髓的保護作用主要是通過提高神經(jīng)營養(yǎng)作用[4，6]、減輕炎癥反應(yīng)[7]、減少細胞凋亡[8]來實現(xiàn)的。作者的前期實驗[6]已經(jīng)證實100 mg/kg的褪黑素具有提高神經(jīng)生長因子表達、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)作用。該實驗結(jié)果顯示SCI后100 mg/kg的褪黑素對大鼠食欲和精神狀態(tài)的改善較為明顯，可能與其有維持生物正常的晝夜節(jié)律、抗疲勞、焦慮、抑郁[9]和鎮(zhèn)痛[10]的作用有關(guān)。實驗中觀察到在SCI晚期B組相對于A組未出現(xiàn)嚴(yán)重的無菌性炎癥反應(yīng)和潰瘍面，說明褪黑素對損傷后的脊髓保護作用是顯著的。

IL-10是一種可以抑制Th1細胞合成細胞因子的因子，被稱為細胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)[11]，SCI后其會反應(yīng)性的顯著增高[7]。Jackson等[12]研究證實IL-10能夠抑制早期炎癥反應(yīng)，特別是對SCI后細胞中的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用。局部膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、中央管周圍內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞在SCI后激活NF-κB[13]，通過自分泌和旁分泌途徑產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-6和IL-8等因子，嚴(yán)重影響組織器官的修復(fù)[14]。這些細胞也產(chǎn)生抗炎性細胞因子IL-10[15]，并對NF-κB表達有明顯的抑制作用[16]，從而也抑制單核巨噬細胞等炎性細胞的浸潤[11-13]。打破這種平衡并增加抗炎因子分泌成為治療的首要途徑。該實驗結(jié)果顯示血清中IL-10的表達量和脊髓中IL-10 mRNA的水平在各個時間點均有B組高于A、C 2組，并且在損傷后第5天出現(xiàn)高峰的現(xiàn)象，證明100 mg/kg的褪黑素能夠影響IL-10的表達，且能夠明顯提高高峰期的表達水平。免疫組化結(jié)果也證實了IL-10蛋白表達的部位及細胞主要集中在中央管周圍的室管膜細胞胞質(zhì)及神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞胞質(zhì)中。

總之，作者的研究結(jié)果可以直接和間接證明褪黑素能通過IL-10起到抗炎與脊髓神經(jīng)修復(fù)的作用。褪黑素對SCI大鼠體內(nèi)IL-10水平的作用是課題組研究的一個開端，作者對褪黑素的理解仍處在初級階段，其對SCI后的修復(fù)作用不僅僅是在一個炎癥因子方面。今后作者還將研究褪黑素對其他的炎癥因子的表達是否有類似的促進作用等。褪黑素有可能成為繼甲強龍后的一個治療急性SCI的有效藥物[17-18]，因此認為褪黑素的應(yīng)用前景非常廣闊。

[1] Stirling DP, Yong VW. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry[J]. J Neurosci Res, 2008, 86(9):1944

[2] 茅磊．王漢東, 脊髓損傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)的研究現(xiàn)狀[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2009,8(12):1291

[3] Esposito E, Genovese T, Caminiti R, et al. Melatonin reduces stress-activated/mitogen-activated protein kinases in spinal cord injury[J]. J Pineal Res, 2009, 46(1):79

[4] Park S, Lee SK, Park K, et al. Beneficial effects of endogenous and exogenous melatonin on neural reconstruction and functional recovery in an animal model of spinal cord injury[J]. J Pineal Res, 2012,52(1):107

[5] 胡愛民，張治國，侯志貞,等.褪黑素對大鼠實驗性脊髓損傷的神經(jīng)保護作用[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011,36(2):164

[6] 徐玉生, 馬玉斐, 李星晨,等, 褪黑素對脊髓損傷早期大鼠神經(jīng)生長因子表達的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2012，47(3):326

[7] Esposito E, Genovese T, Caminiti R, et al. Melatonin regulates matrix metalloproteinases after traumatic experimental spinal cord injury[J]. J Pineal Res, 2008,45(2):149

[8] 郭麗，孫敏，徐蓓蓓，等.褪黑素對溴氰菊酯致大鼠海馬神經(jīng)細胞Bcl-2和細胞色素C表達及細胞凋亡率的影響[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2008,26(4):215

[9] Norrbrink Budh C, Hultling C, Lundeberg T. Quality of sleep in individuals with spinal cord injury: a comparison between patients with and without pain[J]. Spinal Cord,2005,43(2):85

[10]Wilhelmsen M, Amirian I, Reiter RJ, et al. Analgesic effects of melatonin: a review of current evidence from experimental and clinical studies[J]. J Pineal Res,2011,51(3):270

[11]魯葉弘,付強,曾定尹. 血管外膜炎癥大鼠核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,白介素-6,白介素-10的表達及通心絡(luò)的干預(yù)研究[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,8(16):27

[12]Jackson CA, Messinger J, Peduzzi JD, et al. Enhanced functional recovery from spinal cord injury following intrathecal or intramuscular administration of poliovirus replicons encoding IL-10[J]. Virology,2005,336(2):173

[13]Conti P, Kempuraj D, Kandere K, et al. IL-10, an inflammatory/inhibitory cytokine, but not always[J]. Immunol Lett,2003,86(2):123

[14]馮恵民, 李延坤, 呂帥國,等. 丙泊酚麻醉對肝癌射頻消融術(shù)患者血清白介素和HSP70水平的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2012, 47(4):542

[15]張方成，雷德強. 白細胞介素-10抑制脊髓損傷后早期炎癥的實驗研究[J]. 中華實驗外科雜志, 2006，23(12):1579

[16]Jimenez-Garza O, Camacho J, Ibarra J, et al. Early effects of modulating nuclear factor-kappaB activation on traumatic spinal cord injury in rats[J]. Ann N Y Acad Sci,2005,1053:148

[17]Kaptanoglu E, Tuncel M, Palaoglu S, et al. Comparison of the effects of melatonin and methylprednisolone in experimental spinal cord injury[J]. J Neurosurg,2000,93(1 Suppl):77

[18]Cayli SR, Kocak A, Yilmaz U, et al. Effect of combined treatment with melatonin and methylprednisolone on neurological recovery after experimental spinal cord injury[J]. Eur Spine J,2004,13(8):724