廖劍華

(福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，福建 福州 350014)

雙孢蘑菇營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是目前世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費量最大的食用菌，產(chǎn)量約占世界食用菌總產(chǎn)量的40%左右，雙孢蘑菇也是我國目前最大宗的出口創(chuàng)匯食用菌。

應用雙孢蘑菇同核不育株間雜交技術進行品種的改良，獲得的雜交菌株已占蘑菇生產(chǎn)用種的100%。目前同核不育單孢雜交已成為世界上應用最廣泛的方法，它通過單孢分離獲得自體不育的同核單孢子，這種單孢子是自體不育的，只有通過雜交成為異核體，才能出菇結(jié)實。福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所利用同核不育單孢配對雜交，育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆的雙孢蘑菇雜交新菌株As2796、As4607等，占全省蘑菇用種量的95%，全國的80%，累計推廣應用8×108m2以上，增產(chǎn)鮮菇300萬t，新增菇農(nóng)收入100多億元[1]。

雙孢蘑菇雜交品種As2796自1992年選育成功至今已使用20年，在近年的栽培過程中表現(xiàn)出一些氣生菌株的特性，如在濕度較大、通氣不良的菇房中容易形成菌被，出菇過程中水分與通氣管理不當容易產(chǎn)生叢菇，這些現(xiàn)象直接導致雙孢蘑菇的減產(chǎn)，為了減少在栽培中出現(xiàn)的這些不利特性，試圖與貼生親本菌株02進行回交，改良As2796菌株的栽培特性，進一步提高產(chǎn)量。經(jīng)過多次的回交試驗，篩選獲得雜交新菌株W192，該菌株進一步結(jié)合了高產(chǎn)菌株的生長特性，表現(xiàn)為菌絲生長快、不易長菌被、產(chǎn)量高等優(yōu)良性狀，已通過福建省的新品種認定，2012年～2013年產(chǎn)季推廣面積占福建省10%以上。

1 材料與方法

1.1 材料

供試雙孢蘑菇的異核體菌株02(H2型高產(chǎn)品種，引自荷蘭)、As2796(福建蘑菇菌種研究推廣站雜交菌株)，它們的同核體菌株208(HG4s)、286(Hs1)等菌株由福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所提供。

1.2 方法

1.2.2 配對雜交技術

不育同核體的分離培養(yǎng)、鑒定與配對雜交技術，雜交菌株的分離、鑒定步驟均同前法[2－4]。

1.2.3 生物學特性測定

(1)溫度試驗 (栽培種培養(yǎng)基法測定)

同一菌株接種于含水60%的發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基中 (以發(fā)酵棉籽殼為主要基質(zhì)，添加牛糞粉、麥麩等輔助材料)，分別在 10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下培養(yǎng)，每種3次重復，觀察菌株在低溫與高溫下的走菌速率。

(2)培養(yǎng)基含水量試驗

同一菌株分別接種于含水50%、55%、60%、65%和70%的發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基中 (以發(fā)酵棉籽殼為主要基質(zhì)，添加牛糞粉、麥麩等輔助材料)，在24℃下培養(yǎng)，每種3次重復，觀察菌株在不同含水量培養(yǎng)基中的走菌速率。

(3)pH值試驗

PDA培養(yǎng)基分裝于500 mL的三角瓶中，高壓滅菌后，取幾個培養(yǎng)基未凝固的三角瓶，用1 mol·L－1HCl或 1 mol·L－1NaOH進行pH值調(diào)節(jié)，準確記錄調(diào)到各種pH值所需的HCl或NaOH的量，然后在超凈工作臺內(nèi)對各個三角瓶培養(yǎng)基進行pH值調(diào)節(jié)，隨后立即倒入90 mm的培養(yǎng)皿制備成平板培養(yǎng)基。pH值檢測范圍4、5、6、7、8、9、10，每個pH值3次重復，觀察菌株在不同pH值下的走菌速率。

1.2.4 酯酶同工酶測定

酯酶同工酶電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠制備、電泳及結(jié)果分析方法均同前[5，6]。

1.2.5 栽培篩選

(1)初篩

所獲的雜交菌株以塑料淺箱進行栽培，每個淺箱投二次發(fā)酵好的糞草培養(yǎng)料15 kg，面積為0.15 m2，每個菌株均3次重復，在床架上按隨機區(qū)組排列。

(2)復篩

以床架式栽培進行出菇試驗，每區(qū)面積1 m2，投二次發(fā)酵好的糞草培養(yǎng)料60 kg，每菌株4次重復。

(3)中型生產(chǎn)試驗

于2010年～2011年產(chǎn)季在長樂市鶴上鎮(zhèn)希爾帆食用菌有限公司進行中型生產(chǎn)試驗，菇房為永久性紅磚房，采用2次發(fā)酵層架式栽培，中試栽培面積為每個菌株300 m2，設置在同一座菇房，3次重復，每個菌株的培養(yǎng)料投料量與配方相同，堆料、后發(fā)酵、播種、復土時間同步，水份及通風管理按常規(guī)進行。

在初篩、復篩及中試生產(chǎn)試驗過程中，分別觀察不同菌株的菌絲生長速率、栽培特性和產(chǎn)質(zhì)量性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 選育過程

以酯酶同工酶為遺傳標記，從供試異核體親本As2796和02分離出的同核不育菌株，通過配對雜交，獲得雜交種。其中W192菌株是由02分離的同核不育株02－286和As2796分離的同核不育株2796－208配對雜交獲得雜交種 (圖1)。

2.2 生物學特性

2.2.1 溫度適應性

菌株W192菌絲生長溫度試驗結(jié)果表1。

表1 W192菌絲生長溫度試驗結(jié)果

溫度試驗結(jié)果表明，雜交新菌株W192的菌絲生長溫度范圍為10℃～35℃，適宜生長溫度為25℃，致死溫度為35℃。

3.2.2 培養(yǎng)基含水量適應性

菌株W192菌絲生長濕度試驗結(jié)果見表2。

表2 W192菌絲生長濕度試驗結(jié)果

培養(yǎng)基不同含水量試驗結(jié)果表明，雜交新菌株192的菌絲生長的適合范圍為50%～70%，適宜生長的范圍為50%～65%。

3.2.3 pH值適應性

菌株W192菌絲生長平板pH值試驗結(jié)果見表3。

表3 W192菌絲生長平板pH值試驗結(jié)果

平板pH值試驗結(jié)果表明，雜交新菌株W192的菌絲在PDA平板上生長的pH范圍為5～9，適宜生長平板pH為7。

2.3 同工酶分析

菌株同工酶分析結(jié)果見圖2。

雜交新菌株W192的酯酶同工酶表型為HG5型，呈典型的雜合態(tài)，但與親本As2796雜合態(tài)表型存在明顯的差別，其中標記帶A、B是W192特有的酶帶。

2.4 栽培特性

2.4.1 初篩

雜交菌株與對照品種產(chǎn)量、質(zhì)量對比情況見表4。

表4 雜交菌株與對照品種產(chǎn)量、質(zhì)量對比

雜交菌株出菇品比試驗結(jié)果表明，有5株比對照As2796長滿培養(yǎng)料時間快1 d～2 d，采菇時間提早1 d～2 d，產(chǎn)量與高產(chǎn)親本品種02接近，其中W192產(chǎn)量比對照As2796提高23.5%，粒重與對照的優(yōu)質(zhì)親本As2796相當，統(tǒng)計分析顯示雜交新菌株菌株產(chǎn)量與對照菌株As2796相比差異達到極顯著水平。

2.4.2 復篩

部分雜交菌株與對照品種產(chǎn)量、質(zhì)量對比情況見表5。

表5 部分雜交菌株與對照品種產(chǎn)量、質(zhì)量對比

上述優(yōu)選出的5株雜交新菌株經(jīng)過復篩，品比試驗的結(jié)果表明，雜交新菌株與對照As2796產(chǎn)量相比均有較大提高，而粒重與對照的優(yōu)質(zhì)親本As2796相當，其中W192產(chǎn)量提高20%，統(tǒng)計分析顯示雜交新菌株產(chǎn)量與對照菌株As2796相比差異達到極顯著水平。

2.4.3 中試生產(chǎn)試驗

不同菌株生長發(fā)育情況見表6。

表6 不同菌株生長發(fā)育情況

雙孢蘑菇新品種W192菌絲生長為貼生類型菌絲，W2000菌絲生長為半貼生類型，As2796是氣生型菌絲。由表6可見，在栽培種麥粒培養(yǎng)基上，3個品種均為30 d左右透瓶。在床面培養(yǎng)料吃料走菌時間快1 d～2 d，新菌株W192、W2000爬土能力強，出菇時間比As2796快2 d～3 d，出菇潮次比較明顯。各菌株產(chǎn)量比較情況見表7。

表7 各菌株產(chǎn)量比較

由表7可見，從2010年12月12日開始采收雙孢蘑菇到2011年4月12日結(jié)束。各菌株產(chǎn)量分別為W192雙孢蘑菇總產(chǎn)量 3 168.5 kg、平均單產(chǎn) 10.56 kg·m－2，W2000總產(chǎn)量3 048.3 kg、平均單產(chǎn)10.16 kg·m－2，As2796總產(chǎn)量2 634.7 kg，平均單產(chǎn)8.78 kg·m－2;W192、W2000兩菌株分別比對照菌株As2796增產(chǎn)20.2%和15.7%，質(zhì)量與As2796相當(圖3～圖6)。

3 討論

雙孢蘑菇的新品種選育主要采取雜交育種技術，應用雜交菌株與其親本進行回交，可進一步提高雜交菌株的產(chǎn)量。本文通過雜交菌株As2796與其高產(chǎn)親本02的不同配對雜交組合篩選試驗，獲得一系列高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株，雜交菌株在產(chǎn)量上比As2796均有大幅度的提高。

雜交新菌株W192菌絲形態(tài)表現(xiàn)為貼生類型，通過PDA培養(yǎng)基的多次轉(zhuǎn)管，菌絲形態(tài)表現(xiàn)穩(wěn)定，在麥粒培養(yǎng)基上也不會出現(xiàn)菌被，適合于塑料無菌透氣袋菌種的生產(chǎn)。

雜交新菌株W192適用于經(jīng)二次發(fā)酵的糞草料栽培，表現(xiàn)出耐肥、耐水和適應性廣的特點，要求每平方米投料量30 kg～35 kg，C∶N≈(28～30)∶1，含氮量 1.5%～1.6%，含水量65%～68%，pH值在7左右，正常管理的噴水量不少于高產(chǎn)菌株。菌種播種后萌稍慢，菌絲吃料速度中等偏快，生長強壯有力，抗逆性較強，不易出現(xiàn)菌被。菌絲爬土速度中等偏快，紐結(jié)能力強，生長快，因此開采時間比As2796早1 d～2 d。該菌株基本單生，成菇率高，1潮～4潮產(chǎn)量較多，轉(zhuǎn)潮比較明顯，該菌株不宜薄料栽培，料含氮量太低或水分不足都會影響產(chǎn)量或產(chǎn)生薄菇和空腹菇等質(zhì)量不良現(xiàn)象。

[1]王澤生.雙孢蘑菇雜交育種研究進展[J].中國食用菌，1992，11(4):10－12.

[2]Wang HC，Wang ZS.The prediction of strain characteristics of Agaricus bisporus by the application of isozyme electrophoresis [J].Mushroom Science，1989，12(1):87－100.

[3]Wang ZS，Liao JH.Study on the crossbreeding techniques of Agaricus bisporus [J].Microl.Neotrop.，1990(3):1－12.

[4]Wang ZS，Wang HC.Isozyme patterns and charateristics of hybrid strains of Agaricus bisporus [J].Microl.Neotrop.，1990(3):19－29.

[5]Wang ZS，Liao JH，Li FG，et al.Studies on the genetic basis of esterase isozyme loci Est A，B and C in Agaricus bisporus[J].Mushroom Science，1991，13(1):3－9.

[6]王澤生.應用同工酶電泳法分析雙孢蘑菇白色菌株間的種內(nèi)親緣關系 [J].福建食用菌，1991，1(2):20－25.