魏小玲,譚善娟,吳擁軍#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室 鄭州 450001 2)青島市市立醫(yī)院醫(yī)院感染管理科 青島 266071

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤[1-3]。肺癌的預(yù)后取決于早期診斷和有效的治療，尋找肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的早期效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志成為肺癌研究的焦點(diǎn)。端粒是由非編碼TTAGGG重復(fù)和相關(guān)的端粒結(jié)合蛋白組成的核蛋白復(fù)合物，其主要功能是維護(hù)染色體的完整性和穩(wěn)定性，防止染色體的降解和融合[4]。許多研究[5-6]都在探索端?？s短與癌癥危險(xiǎn)性的關(guān)系，但結(jié)果仍有爭(zhēng)議。目前關(guān)于端粒長(zhǎng)度與肺癌關(guān)系的研究尚無(wú)定論。Jang等[5]報(bào)道外周血基因組DNA端?？s短可能是肺癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素，但Shen等[6]研究卻發(fā)現(xiàn)肺癌患者血液中端粒相比正常對(duì)照變長(zhǎng)。作者應(yīng)用熒光定量PCR法測(cè)定肺癌患者、正常對(duì)照的外周血基因組DNA端粒長(zhǎng)度，探討外周血基因組DNA端粒長(zhǎng)度與肺癌的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象200例肺癌患者選自2009年1月至2010年5月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科確診病例,均經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肺癌，其中鱗狀細(xì)胞癌87例，腺癌72例，其他類型41例；Ⅰ+Ⅱ期55例，Ⅲ+Ⅳ期145例。200例正常對(duì)照選自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院正常體檢人群，體檢中未發(fā)現(xiàn)肺部或其他器官腫瘤。經(jīng)知情同意后由專業(yè)調(diào)查員和醫(yī)生收集一般資料并采集標(biāo)本。一般資料包括性別、年齡、吸煙史等，其中吸煙的定義為1支/d且吸煙1 a以上。

1.2外周血基因組DNA的提取抽取研究對(duì)象靜脈血3 mL，外周血基因組DNA提取按照上海萊風(fēng)生物技術(shù)公司DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度(A)值，選取A(260 nm)/A(280 nm)介于1.7～2.0的樣品用于試驗(yàn)。

1.3相對(duì)端粒長(zhǎng)度(RTL)的測(cè)定采用美國(guó)Startagene公司的MX3000P PCR儀，參考實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法[7]進(jìn)行RTL測(cè)定。端?；虻囊镄蛄蠺el1：5’-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’,Tel2：5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’。內(nèi)參引物序列GAPDH1：5’-TACTAGCGGTTT TACGGGCG-3’，GAPDH2：5’-GAACAGGAGGAGCA GAGAGCGA-3’。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×SYBY q PCR Master Mix(Promega, 美國(guó))10 μL, 10 mmol/L引物0.5 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)條件： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s,61 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。用PCR儀自帶的軟件分析數(shù)據(jù)。根據(jù)陰性對(duì)照和基線確定Ct值，并根據(jù)溶解曲線確定Ct值的有效性。每個(gè)樣品均做3個(gè)平行樣并取均值作為該樣品的Ct值，每一輪PCR反應(yīng)均設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照以排除假陽(yáng)性結(jié)果。ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示RTL。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2組性別構(gòu)成、吸煙狀態(tài)的比較用χ2檢驗(yàn)；2組年齡、RTL的比較，不同臨床病理特征患者RTL的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析；采用非條件logistic回歸分析RTL與肺癌危險(xiǎn)性的關(guān)系；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血基因組DNARTL的比較研究對(duì)象的一般情況見(jiàn)表1。2組年齡、吸煙狀態(tài)構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故分層比較RTL，見(jiàn)表2。

表1 2組研究對(duì)象的一般特征

表2 2組外周血基因組DNA RTL的比較

2.2RTL與肺癌危險(xiǎn)性的logistic回歸分析按對(duì)照組RTL的中位數(shù)為分界點(diǎn)，分別將2組分成2層(RTL>0.95和≤0.95，分別賦值0和1),將RTL、年齡、吸煙狀態(tài)納入非條件logistic回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3不同臨床病理特征肺癌患者外周血基因組DNARTL的比較見(jiàn)表4。

表3 非條件logistic回歸分析結(jié)果

表4 不同臨床病理特征肺癌患者RTL的比較 例

3 討論

端粒的作用是保護(hù)染色體的完整性和穩(wěn)定性，但極易受外源性理化因素的攻擊。正常體細(xì)胞中染色體按照傳統(tǒng)的機(jī)制復(fù)制造成端粒復(fù)制不完全，因末端復(fù)制問(wèn)題導(dǎo)致端粒在每個(gè)細(xì)胞分裂周期都會(huì)縮短50～100 bp，當(dāng)端?？s短到臨界長(zhǎng)度時(shí)，細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)衰老以致死亡[8]。當(dāng)有外源性理化因素的刺激時(shí)，端?？s短會(huì)越過(guò)臨界點(diǎn),使染色體損傷，而染色體損傷可能是腫瘤發(fā)生過(guò)程中一個(gè)重要的遺傳學(xué)機(jī)制。端粒長(zhǎng)度變化反映了端粒結(jié)構(gòu)和功能的改變，可作為一項(xiàng)DNA/染色體穩(wěn)定性改變的早期指標(biāo)[9-10]。

Han等[11]報(bào)道端粒長(zhǎng)度與患黑色素瘤的危險(xiǎn)性正相關(guān)，但與患基底細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)負(fù)相關(guān)。Jang等[5]報(bào)道外周血基因組DNA端?？s短可能是患肺癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素。該研究結(jié)果表明，肺癌組外周血基因組DNA RTL要短于對(duì)照組；非條件logistic回歸分析結(jié)果表明，將年齡和吸煙狀態(tài)作為混雜因素進(jìn)行校正后，按對(duì)照組的中位數(shù)將RTL分成2層，短端粒患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)是長(zhǎng)端粒的3.264倍。Jang等[5]亦認(rèn)為端?？s短是肺癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素，可以作為肺癌早期的敏感指標(biāo)。因此，外周血基因組DNA RTL可用于預(yù)測(cè)患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，且外周血取材方便，適宜隨訪監(jiān)測(cè)。雖然該研究未發(fā)現(xiàn)吸煙水平對(duì)端粒長(zhǎng)度有影響，但有報(bào)道[12]顯示端粒長(zhǎng)度隨著吸煙劑量的增加出現(xiàn)變短的趨勢(shì)。

該研究結(jié)果顯示，不同組織學(xué)類型和不同臨床分期的肺癌患者外周血基因組DNA的RTL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示端粒長(zhǎng)度與肺癌的進(jìn)展可能無(wú)關(guān)。

綜上所述，端?？s短可增加患肺癌的危險(xiǎn)性，可能是肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的早期效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志，但其與肺癌的進(jìn)展可能無(wú)關(guān)；外周血基因組DNA的RTL檢測(cè)可用于肺癌風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)。

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