王 娜，冷 弘，李 敏，臧文巧 ，王媛媛

1)鄭州大學基礎醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室 鄭州 450001 2)洛陽職業(yè)技術學院免疫學與病原生物學教研室 洛陽 471000

細胞增殖是細胞生命活動的重要特征之一，細胞增殖受調控機制的嚴密監(jiān)控，不受約束的細胞增殖將導致細胞癌變。細胞周期蛋白在細胞增殖調控中發(fā)揮重要作用[1]。G1期周期蛋白Cyclin E能夠與CDK2一起促進細胞周期G1/S轉換，進而促進細胞分裂。臨床研究[2]發(fā)現(xiàn)，Cyclin E基因mRNA及蛋白過表達與癌癥的發(fā)生有一定關系，提示Cyclin E過表達是癌變早期事件。RNA干擾技術可以特異阻斷或降低其靶向基因的表達，在抑制腫瘤生長的基礎研究[3]方面取得了一定的進展。該研究旨在構建Cyclin E基因RNA干擾載體，建立其穩(wěn)定轉染EC9706細胞系，為深入研究Cyclin E和食管癌發(fā)生的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料人食管癌細胞株EC9706(鄭州大學基礎醫(yī)學院實驗中心保存)；pRNAT-CMV3.1/Neo載體(購自美國GenScript公司)；BamHⅠ、AflⅡ內切酶、T4 DNA連接酶、氨芐青霉素、新霉素(購自大連寶生物工程有限公司)；質粒DNA提取純化試劑盒(購自北京天澤基因科技有限公司)；小量總RNA提取試劑盒(購自德國Qiagen公司)；熒光定量PCR試劑盒(購自大連寶生物工程有限公司)；鼠抗Cyclin E單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體、鼠抗GAPDH抗體(購自美國Santa Cruz公司)；LipofectamineTM2000 (購自美國 Invitrogen公司)；小量DNA膠回收純化試劑盒(購自廣州東盛生物科技有限公司)。

1.2靶向CyclinE基因siRNA的設計、合成、退火利用Dharmacon公司提供的siRNA靶片段分析設計在線軟件siDESIGN Center，掃描人Cyclin E mRNA 編碼序列(NM_057182.1)，經BLAST同源性分析，確定951～969位和1 122～1 140位為siRNA靶序列，合成2對編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈(ss1F、ss1R和ss2F、ss2R)，兩端分別加上BamHⅠ和AflⅡ內切酶殘基。4條DNA單鏈分別為ss1F 5’-GATCCGCAAAAGGTTTCAGGGTATTTCAAGAGAAT

ACCCTGAAACCTTTTGCTTTTTTC-3’(59 bp),ss1R 5’-TTAAGAAAAAAGCAAAAGGTTTCAGGGTATTCTCTTG

AAATACCCTGAAACCTTTTGCG-3’(59 bp)，ss2F 5’-GATCCGGACAAAGCCCGAGCAAAGTTCAAGAGACTT

TGCTCGGGCTTTGTCCTTTTTTC-3’(59 bp)，ss2R 5’-TTAAGAAAAAAGGACAAAGCCCGAGCAAAGTCTCTT

GAACTTTGCTCGGGCTTTGTCCG-3’(59 bp)。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。去離子水70 μL溶解短發(fā)夾DNA單鏈，退火反應體積50 μL，退火體系如下：10×退火B(yǎng)uffer 5 μL，DNA單鏈ss1F、ss1R(或ss2F、ss2R)各22.5 μL。退火反應：95 ℃ 6 min，70 ℃ 8 min，緩慢降至30 ℃維持10 min，緩慢降至4 ℃。20 g/L低熔點瓊脂糖凝膠電泳，小量DNA膠回收純化試劑盒回收純化。獲得DNA雙鏈ds1、ds2。

1.3siRNA載體質粒線性化BamHⅠ和AflⅡ酶切siRNA載體pRNAT-CMV3.1/Neo，酶切體系如下：10×緩沖液5 μL，BamHⅠ 2 μL，AflⅡ 2 μL，pRNAT-CMV3.1/Neo 41 μL。37 ℃水浴2 h，70 ℃ 5 min滅活內切酶BamHⅠ和AflⅡ。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大片段線性雙黏siRNA載體pRNAT-CMV3.1/Neo。

1.4發(fā)卡樣退火產物與siRNA載體的重組T4 DNA連接酶連接ds1、ds2與線性雙黏siRNA載體pRNAT-CMV3.1/Neo。連接反應：2×Buffer 5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，膠回收退火產物各3 μL，線性雙黏siRNA載體pRNAT-CMV3.1/Neo 1 μL。4 ℃過夜連接。獲得重組產物pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1、pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2。轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。

1.5重組質粒的篩選鑒定從終質量濃度50 mg/L氨芐青霉素LB平板上各挑取2個菌落劃線接種于LB平板上，培養(yǎng)16～18 h，再轉種入氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12 h。采用北京天澤基因科技有限公司柱式質粒DNA提取純化試劑盒分別提取轉化質粒。送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.6重組質粒轉染EC9706細胞提取純化pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1、pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2和pRNAT-CMV3.1/Neo-Con質粒。復蘇EC9706細胞，按Invitrogen公司轉染試劑LipofectamineTM2000操作說明轉染EC9706細胞。轉染分4組，干擾1組(轉染pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1)、干擾2組(轉染pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2)、無關siRNA對照組(轉染pRNAT-CMV3.1/Neo-Con)、空白對照組(不轉染任何質粒，僅用脂質體處理),18 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察，488 nm最大波長激發(fā)。轉染12 h后，用含有400 mg/L新霉素和青、鏈霉素的完全培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)，3～4周后得到大量穩(wěn)定轉染細胞進行各項檢測和試驗。

1.7RT-PCR檢測CyclinEmRNA表達使用Qiagen公司小量總RNA提取試劑盒提取各組轉染細胞總RNA，AMV逆轉錄成cDNA。使用寶生物工程有限公司的熒光定量PCR試劑盒擴增，Cyclin E擴增引物5’-CGGGTCCACAGGGATGCGAAGGA-3’和5’-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA-3’。內參GAPDH擴增引物5’-GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3’和5’-CAATGCCAGCCCCAGCGTCA-3’。擴增反應條件：94 ℃預變性20 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。每個標本均擴增5管，以Cyclin E的表達量與內參GAPDH表達量的比值作為Cyclin E的相對表達量。

1.8Western-blot檢測CyclinE蛋白表達裂解各組細胞，用Bradford法測定上清中蛋白濃度以調整上樣體積和上樣量。SDS-PAGE凝膠100 V，電泳1 h，轉膜。置膜于25 mL封閉緩沖液中1 h。1800鼠抗Cyclin E單克隆抗體及鼠抗GAPDH，室溫孵育1～2 h。12 000辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育1 h，顯色。成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0進行分析處理, 各組細胞Cyclin E mRNA相對表達量的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1靶向CyclinE基因siRNA載體構建結果

2.1.1 發(fā)卡樣DNA的退火結果 ss1F、ss1R、ss2F、ss2R發(fā)卡樣DNA寡核苷酸單鏈，退火形成DNA雙鏈產物ds1和ds2，退火后電泳可見明亮條帶，位于100 bp下接近100 bp處，與設計一致，見圖1。

2.1.2 重組載體插入序列測序結果 從轉化大腸桿菌DH5α細菌中提取載體質粒，對插入序列進行測序。將插入序列分別與所設計序列進行比對，序列完全相同，無堿基差異，見圖2、圖3?？梢娭亟M載體中插入序列與所設計序列一致，發(fā)卡樣雙鏈DNA序列成功重組到siRNA載體上。

2.2轉染結果倒置熒光顯微鏡下觀察，干擾1組、干擾2組、無關siRNA對照組可見到有綠色熒光蛋白表達，細胞呈現(xiàn)綠色熒光，隨后逐漸增加，1周

后熒光趨于穩(wěn)定；空白對照組細胞則無熒光。見圖4。

圖1 siRNA發(fā)卡樣DNA的退火電泳結果

1：ss1F、ss1R發(fā)卡樣單鏈DNA退火產物；2：ss2F、ss2R發(fā)卡樣單鏈DNA退火產物；M：Marker。

圖2 pRNAT-CMV3.1/Neo-ds1插入序列與設計序列ss1F比對結果

圖3 pRNAT-CMV3.1/Neo-ds2插入序列與設計序列ss2F比對結果

2.3RT-PCR檢測各組細胞CyclinEmRNA表達結果各組細胞Cyclin E mRNA的相對表達量見表1。

圖4 倒置熒光顯微鏡下各組轉染細胞(×200)

2.4免疫印跡結果干擾1組、干擾2組、空白對照組、無關siRNA對照組細胞在大約54 000處均有免疫印跡出現(xiàn)，其中空白對照組和無關siRNA對照組的免疫印跡強于干擾1組和干擾2組，見圖5。

表1 各組細胞Cyclin E mRNA相對表達量比較

F=15.381，P=0.002；*與空白對照組、無關siRNA對照組比較，P均<0.05。

圖5 Western-blot結果

1：干擾1組；2：干擾2組；3：無關siRNA對照組；4：空白對照組。

3 討論

細胞的增殖是受到機體內外環(huán)境不同水平嚴密監(jiān)控的，細胞增殖失去控制導致異常增殖則形成腫瘤[4]。周期蛋白與其他調控物質共同構成了細胞周期和細胞增殖調控的復雜網絡。目前已分離的周期蛋白有數(shù)十種，在控制細胞分裂過程中執(zhí)行多種多樣的功能，保證細胞周期的正常運行。細胞周期蛋白在腫瘤的發(fā)病機制、基因治療等基礎研究[5-9]方面取得一定進展。

Cyclin E是一種G1期周期蛋白，是細胞能夠通過細胞周期限制點“R”的一個限制因素。Cyclin E通過活化周期蛋白依賴性蛋白激酶2，級聯(lián)活化其下游一系列蛋白質，促進G1/S期的轉換[10-11]。在正常細胞周期中，Cyclin E的消長是受到嚴密控制的。Cyclin E的過度表達，導致細胞分裂不受控制，引起腫瘤[12-13]。RNA干擾技術可以特異阻斷或降低其靶向基因的表達，通過抑制引起腫瘤發(fā)生的重要蛋白的表達而抑制腫瘤的生長、黏附、侵襲、耐藥等能力[14-16]。研究者[17-19]從不同的角度揭示了Cyclin E基因和癌癥發(fā)生的關系。

該研究設計合成了靶向Cyclin E基因的siRNA，連接入pRNAT-CMV3.1/Neo載體，成功構建了靶向Cyclin E基因的RNA干擾載體。轉染人食管癌細胞CE9706后，干擾1組、干擾2組與空白對照組和無關siRNA對照組比較，Cyclin E mRNA的相對表達量顯著降低，Cyclin E蛋白表達量明顯下降。

試驗結果提示，所構建的靶向Cyclin E基因RNA干擾載體在細胞內能有效降低Cyclin E 蛋白表達。為進一步深入研究所構建載體對食管癌細胞CE9706增殖、黏附、侵襲能力的影響奠定了基礎。

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