盛黎黎 李 靖 張志強(qiáng) 李 斌 楊天嬌 吳云霞△

1 武警湖北總隊(duì)醫(yī)院病理科，武漢 430061

2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥系，武漢 430030

隨著西藥在免疫抑制的運(yùn)用中逐漸顯現(xiàn)出的一系列不良反應(yīng)和毒副作用，人們逐步認(rèn)識(shí)到從中藥中尋求新的抗免疫排斥反應(yīng)的藥物可能是一個(gè)新的途徑。本實(shí)驗(yàn)將具有益氣活血作用的黃芪等藥物按一定比例應(yīng)用于大小鼠間背－背皮膚移植模型，取得較好療效，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SD大鼠36只，雌性，8～12周齡，體重約200g；清潔級(jí)昆明小鼠36只，雌性，健康且未交配，8～12周齡，體重25～30g［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（鄂）2004－2007］。在室溫18℃～22℃，相對(duì)濕度70%～85%的動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，自由攝食，飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

由黃芪、黃芩、續(xù)斷、白術(shù)、丹參5味中藥按一定比例組成，采用60%乙醇回流提取，揮干乙醇，濃縮至每1ml含生藥1g（1g／ml），4℃保存?zhèn)溆茫ㄋ幉挠晌錆h康樂大藥房提供并粉碎）；醋酸地塞米松（H33020822，浙江仙珺制藥股份有限公司，批號(hào)：0804107）用生理鹽水溶解，配成0.075mg／ml的溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取SD大鼠，腹腔注射25%烏拉坦麻醉后，剔去背部毛發(fā)，剪下背部皮膚適當(dāng)大小，用刀片切成1.0cm×1.0cm大小的皮片20片，置生理鹽水培養(yǎng)皿中浸泡備用。將受體小鼠隨機(jī)分成3組，每組12只，分別用25%烏拉坦腹腔麻醉，剔去背部鼠毛，75%醫(yī)用酒精消毒后，剪下背部1.0cm×1.0cm大小的皮膚，撒上適量青霉素鈉消炎，即為植床，自培養(yǎng)皿中取出供皮，吸干水分，將供皮平鋪于植床上，創(chuàng)可貼適當(dāng)加壓包扎［1］。于手術(shù)當(dāng)天開始灌藥，至觀察終點(diǎn)。中藥組：中藥醇提取物相當(dāng)于生藥材16.00g／kg·d灌胃；陽性對(duì)照組：醋酸地塞米松溶液，第1、2天0.90g／kg·d灌胃，第3、4天0.75g／kg·d灌胃，第5、6天0.60g／kg·d灌胃，之后逐漸減少至0.30g／kg·d，并維持該劑量給藥；陰性對(duì)照組：生理鹽水灌胃。術(shù)后第5、10天各組剪下其移植皮片，置4%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，蘇木精－伊紅染色，光鏡觀察；每組剩余小鼠繼續(xù)用藥，記錄皮片存活時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植皮片生長(zhǎng)情況

陰性對(duì)照組移植皮片術(shù)后2d皮片蒼白柔軟，第3天起逐漸變紅潤(rùn)，從第8天起皮片顏色逐漸由紅潤(rùn)變成暗紅，質(zhì)地逐漸由柔軟變干變硬，平均第11天完全變黑變硬壞死，隨即脫離。中藥組術(shù)后2d皮片蒼白柔軟，第3天起逐漸變紅潤(rùn)，從第11天起皮片顏色逐漸由紅潤(rùn)變成暗紅，質(zhì)地逐漸由柔軟變干變硬，平均第15天完全變黑變硬壞死，隨即脫離。陽性對(duì)照組術(shù)后前幾天變化同中藥組，從第11天起皮片顏色逐漸由紅潤(rùn)變成暗紅，質(zhì)地逐漸由柔軟變干變硬，第12天起小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡不振，全身震顫等現(xiàn)象，并逐漸加重，皮片平均至第16天完全變黑變硬壞死，隨即脫離。

2.2 移植皮片存活率和存活時(shí)間

異種皮膚移植急性排斥反應(yīng)約發(fā)生在移植后1周，移植后第5天觀察各組移植皮片存活良好，各組間存活面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，移植后第10天觀察各組移植皮片，中藥組存活面積明顯大于陰性對(duì)照組（P＜0.05），且優(yōu)于陽性對(duì)照組，中藥組和陽性對(duì)照組移植皮片存活時(shí)間較陰性對(duì)照組明顯延長(zhǎng)。見表1。

表1 移植皮片存活情況（n＝12）

2.3 移植后第5天移植皮膚組織學(xué)觀察

移植后第5天見各組皮膚失去正常結(jié)構(gòu)，角質(zhì)層增厚，表皮層變薄，皮膚附屬器減少，全層細(xì)胞數(shù)目減少。陰性對(duì)照組明顯見正常皮膚與移植皮膚交界處和真皮層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核溶解壞死，少有再生纖維組織；中藥組和陽性對(duì)照組正常皮膚與移植皮膚交界處和真皮層少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核溶解壞死，但伴較多再生纖維組織。見圖1。

2.4 移植后第10天移植皮膚組織學(xué)觀察

移植后第10天見各層皮膚失去正常結(jié)構(gòu)，角質(zhì)層增厚，表皮層、皮膚附屬器減少甚至消失，全層細(xì)胞數(shù)目劇烈減少。陰性對(duì)照組明顯見正常皮膚與移植皮膚交界處和真皮層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核溶解壞死；中藥組和陽性對(duì)照組正常皮膚與移植皮膚交界處和真皮層少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核溶解壞死，再生纖維組織減少。見圖2。

3 討論

現(xiàn)階段常用的激素類免疫抑制劑（如本實(shí)驗(yàn)中所用的地塞米松），雖然在免疫抑制方面效果很好，作用很強(qiáng)，但其毒副作用也相應(yīng)很大［2－3］。本實(shí)驗(yàn)表明，在安全劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠使用這類藥物超過12d左右，小鼠會(huì)出現(xiàn)精神萎靡不振、毛發(fā)聳立等明顯毒副作用，而中藥組既有較好的免疫抑制作用，可延長(zhǎng)移植皮片的存活時(shí)間，且無明顯毒副作用。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)移植后第5天移植皮片與正常皮膚交界處較早出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而移植皮片與植床的交界處，即皮下組織處，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等免疫排斥現(xiàn)象的時(shí)間稍晚，本實(shí)驗(yàn)中藥是由續(xù)斷、黃芪、白術(shù)、丹參、黃芩組成的復(fù)方，該方以益氣健脾，清熱安胎，養(yǎng)血活血立法，前期主要運(yùn)用于促進(jìn)胚泡著床，防止流產(chǎn)，取得較好療效［4］，其安胎機(jī)制與抑制NF－κB的表達(dá)和促進(jìn)新血管生成相關(guān)，因此設(shè)想將其試用于移植排斥反應(yīng)，實(shí)

驗(yàn)結(jié)果表明該復(fù)方中藥可以明顯抑制皮膚交界處及皮下組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并抑制引起排斥反應(yīng)，其效果與地塞米松相似。本方主要以益氣活血安胎為其主要藥物組成，也有報(bào)道［5－6］將其他不同安胎中藥用于腎急性排斥反應(yīng)，取得較好療效，考慮益氣活血安胎中藥的實(shí)質(zhì)即與抑制排斥反應(yīng)有關(guān)，益氣活血安胎中藥中可能有抑制免疫排斥和直接抑制NF－κB的活性成分，值得以后進(jìn)一步深入研究，這些藥物如被開發(fā)，將具有廣闊的開發(fā)運(yùn)用前景。

圖1 移植后第5天皮膚病理切片（蘇木精－伊紅染色，×100）

圖2 移植后第10天皮膚病理切片（蘇木精－伊紅染色，×100）

［1］樊擁軍，張鳳蘊(yùn)，張飚，等.一種簡(jiǎn)單的小鼠皮膚移植方法［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，34（5）：332－333.

［2］夏寶森，李小康.FTY720：一個(gè)來源于冬蟲夏草的新型免疫抑制劑［J］.上海免疫學(xué)雜志，2002，22（2）：79－81.

［3］R.比林厄姆，W.西爾弗斯.移植免疫生物學(xué)［M］.楊松榆，譯.北京：科學(xué)出版社，1979：210－211.

［4］WU YX，ZHENG CH，HU LL，et al.Local immune regulatory effects of Bangdeyun on the endometrium of mice with embryo implantation dysfunction during the implantation time［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29（3）：372－376.

［5］王巍，畢旭東，孫德光，等.中藥安胎養(yǎng)血合劑對(duì)大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)免疫抑制作用的研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34（10）：1482－1484.

［6］孫德光，畢旭東，趙晶，等.中藥安胎養(yǎng)血合劑對(duì)大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)影響的初步研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（3）：517－519.