焦喜來 尹大川 Ilan Chet 鄧 勛 宋瑞清*

(1.黑龍江豐林國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，黑龍江 伊春 153033；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.以色列耶路撒冷希伯萊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院)

沙棘(Hippophaerhamnoides)是多年生的灌木或小喬木，具有極強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，對于防風(fēng)、固沙、防止水土流失、治理生態(tài)環(huán)境方面具有重要意義[1]。沙棘干縮病是世界范圍內(nèi)危害沙棘最嚴(yán)重的毀滅性病害，是所有沙棘栽培區(qū)都可能出現(xiàn)的危險(xiǎn)性病害。研究發(fā)現(xiàn)引起沙棘干縮病的病原菌為擬枝孢鐮孢菌(Fusariumsporotrichoides)[2～3]，沙棘干縮病的發(fā)生、蔓延是目前困擾沙棘產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素。此病造成提前落葉，常常較健康樹木提早30d以上落葉，造成樹勢早衰、有效壽命縮短，連續(xù)發(fā)病3～4年可致死亡，果實(shí)品質(zhì)下降，產(chǎn)量損失達(dá)40%以上，對沙棘危害極大[4]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是拮抗微生物，具有抗菌譜廣、適應(yīng)性強(qiáng)和多機(jī)制性的特點(diǎn)。對多種病原菌有抑制作用。此外還具有重寄生作用，通過胞外酶破壞病原菌細(xì)胞壁，削弱病原菌的生長勢，甚至殺死病原菌。目前世界范圍內(nèi)已有以木霉菌為主要成分的生物殺菌劑，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用[5～6]。同時(shí)，木霉菌對植物還具有促生抗逆的作用，通過定殖和次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長，提高其抗病能力[6]。本研究選用自以色列引進(jìn)的木霉菌株T43及其次生代謝產(chǎn)物，研究其對沙棘干縮病病原菌的抑制效果和抑菌機(jī)理，為進(jìn)一步有效控制沙棘干縮病打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

實(shí)驗(yàn)所用木霉菌株T43和擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichoides)由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理教研室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株T43對擬枝孢鐮孢菌的拮抗效果

采用平板對峙培養(yǎng)法。在直徑90mm的PDA平板上，相距50mm分別接入直徑10mm、培養(yǎng)5d的木霉菌株和病原菌株的菌片。以在平板中心接種直徑10mm的各菌株菌片作為對照。每處理3個(gè)重復(fù)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4d后用十字交叉法測量菌落的趨向半徑，計(jì)算抑制率、相對抑制效果和拮抗系數(shù)。

被抑制率={[(單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑)-(菌落趨向半徑)]/(單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑)}×100%

相對抑制效果=病原菌被抑制率/拮抗菌被抑制率

1.2.2 菌株T43非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對擬枝孢鐮孢菌的抑制作用

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯作為萃取劑獲得的提取物抑菌效果較高，適宜的萃取比例為發(fā)酵液∶乙酸乙酯=1∶3(V/V)。因此該研究采用乙酸乙酯作為萃取劑，對T43發(fā)酵液進(jìn)行萃取，以獲得非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，即乙酸乙酯提取物。

木霉菌株發(fā)酵液的制備：用直徑10mm打孔器切取培養(yǎng)好的木霉菌株菌落，分別接入盛有300mL PD培養(yǎng)基的三角瓶(500mL)中，每瓶接種4片，置于搖床(25℃、120r/min)上培養(yǎng)5d，獲得發(fā)酵液。無菌紗布過濾后，取濾液備用。

乙酸乙酯提取物的制備：乙酸乙酯與濾液按1∶3(V/V)的比例混合，常溫靜置2d，分液去除無機(jī)相后，低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，將所得固體樣品用5mL 10%的吐溫80溶解，除菌過濾，即得乙酸乙酯提取物樣品。

抑菌活性檢測：采用混合培養(yǎng)基法。將5mL乙酸乙酯提取物與500mL PDA培養(yǎng)基均勻混合，制成平板，中央接種直徑為10mm的病原菌株菌片，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，測量菌落直徑大小(十字交叉)。以含10%吐溫80的無菌水作對照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。根據(jù)以下公式計(jì)算抑菌率。

抑菌率=[(對照凈生長量-處理凈生長量)/對照凈生長量]×100%

1.2.3 木霉菌株T43發(fā)酵液提取物對病原菌抗氧化保護(hù)酶的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是植物體中典型的抗氧化保護(hù)酶，所以本研究選擇這三種酶進(jìn)行抑菌機(jī)理的初步探究。

無菌條件下切取病原菌株平板培養(yǎng)菌落，用無菌水沖洗2～3次，吸干水分。室溫下，將菌片分別用菌株T43發(fā)酵液提取物浸泡2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h，以無菌水浸泡菌片作為對照。

(1)SOD粗酶液制備：稱取不同處理時(shí)間的病原菌菌片1g，按1∶10(W/V)加入10mL 50mmol PL、pH7.8的冷磷酸緩沖液，冰浴研磨，冷凍離心(4℃，10 000rpm)20min。取上清液[7]。單位定義：每克菌絲體在1mL反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位。

(2)CAT與POD粗酶液制備：稱取不同處理時(shí)間的病原菌菌片1g，按1∶10(W/V)加入10mL 50mmol PL、pH7.0的冷磷酸緩沖液，冰浴研磨，冷凍離心(4℃，10 000rpm)20min。取上清液[8]。

3種酶的活性測定使用南京建成公司生產(chǎn)的試劑盒。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株T43對擬枝孢鐮孢菌的拮抗效果

對峙培養(yǎng)96h后，菌株T43對病原菌生長抑制率為44%，相對抑制效果為0.75，木霉菌株生長速度快，競爭系數(shù)高，在同病原菌對峙培養(yǎng)中，迅速占領(lǐng)生態(tài)位。而病原菌開始生長較快，但在與木霉接觸后生長受到抑制，在木霉的抑制下幾乎停止生長，并最終與木霉形成明顯的拮抗線(圖1)。

2.2 菌株T43乙酸乙酯提取物對擬枝孢鐮孢菌的抑制效果

在培養(yǎng)96h后，病原菌菌落直徑明顯小于對照組，說明木霉菌株發(fā)酵液提取物對病原菌生長具有一定的抑制作用(圖2)，其抑制率為46.10%，其菌絲也較對照組稀疏，生長較弱且生長緩慢。

2.3 菌株T43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對擬枝孢鐮孢菌抗氧化保護(hù)酶的影響

菌株T43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對擬枝孢鐮孢菌抗氧化保護(hù)酶均有不同程度的影響(圖3～圖5)。

(1)對超氧化物歧化酶(SOD)的影響：木霉菌株T43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對病原菌SOD有明顯的抑制作用(圖3)。經(jīng)乙酸乙酯提取物處理后，病原菌SOD在4～10h出現(xiàn)短暫的上升之后，在10h時(shí)達(dá)到峰值，為68μg/g，在10h后直線下降，出現(xiàn)了明顯的拐點(diǎn)，與對照組形成鮮明的對比。

(2)對過氧化氫酶(CAT)的影響：木霉菌株T43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對病原菌CAT有明顯的抑制作用(圖4)。經(jīng)乙酸乙酯提取物處理后，病原菌CAT在4～8h出現(xiàn)短暫的上升之后，在8h時(shí)達(dá)到峰值，為0.049μg/g，在8h后直線下降，出現(xiàn)了明顯的拐點(diǎn)，24h降到最低為0.01μg/g。對照組在達(dá)到最高后數(shù)值趨于平穩(wěn)。

(3)對過氧化物酶(POD)的影響：木霉菌株T43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對病原菌POD有明顯的抑制作用(圖5)。經(jīng)過處理后，病原菌SOD在4～10h出現(xiàn)短暫的上升之后，在10h時(shí)達(dá)到峰值，為6μg/g，在10h后直線下降，出現(xiàn)了明顯的拐點(diǎn)，24h降到最低為2μg/g。對照組則一直上升，最后穩(wěn)定在8μg/g。

3 結(jié)論

通過木霉菌株T43對沙棘干縮病菌的抑制效果及其抑菌機(jī)理的初步研究，得出以下結(jié)論：(1)木霉菌株T43對擬枝孢鐮孢菌具有一定的拮抗效果；(2)菌株T43乙酸乙酯提取物中含有抑菌活性成分，抑制沙棘干縮病病原菌的生長；(3)菌株T43乙酸乙酯提取物可顯著降低病原菌3種抗氧化保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)活性，對病原菌的膜保護(hù)系統(tǒng)有一定的破壞作用。

參考文獻(xiàn)：

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[7]鄧龍,鄧勛,尹大川，等.引進(jìn)木霉菌株T-43對樟子松枯梢病菌的抑制效果[J].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,25(3):38～39.

[8]張芹.松針褐斑病菌(Lecanostictaacicola)毒素致病作用的細(xì)胞學(xué)研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué)學(xué)位論文,2003.