安崇文， 李海霞

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，北京100034)

近年來，國內(nèi)外研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，Cys C)已經(jīng)成為反映腎小球濾過率功能受損的一個較理想的早期標(biāo)志物［1-2］。目前Cys C檢測系統(tǒng)較多，檢測原理不盡相同。美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)室間質(zhì)評結(jié)果顯示Cys C檢測存在差異性較大，2011和2012年度所有參加實驗室的變異系數(shù)(CV)為13.3%～30.7%，且采用歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ERM-DA471)進(jìn)行的正確度評價未見報道。因此，我們對目前國內(nèi)常用檢測系統(tǒng)［包括5個顆粒增強(qiáng)膠乳透射免疫比濁法(particle-enhanced latex turbidimetric immunoassay，PETIA)檢測系統(tǒng)、1個顆粒增強(qiáng)聚苯乙烯散射免疫比濁法(particle-enhanced polystyrene nephelometric immunoassay，PENIA)檢測系統(tǒng)、1個膠體金均相溶膠顆粒免疫(colloidal gold homogeneous sol particle immunoassay，SPIA)檢測系統(tǒng)］進(jìn)行評價，分析其精密度、空白限(LoB)、抗干擾性以及正確度驗證等性能，證實其是否能滿足預(yù)期臨床用途。

材料和方法

一、儀器試劑與樣本準(zhǔn)備

1.檢測系統(tǒng) 5個PETIA檢測系統(tǒng)和1個SPIA檢測系統(tǒng)以A～F表示，PENIA檢測系統(tǒng)簡稱為BNⅡ系統(tǒng)。各檢測系統(tǒng)試劑、校準(zhǔn)液批號見表1。

表1 檢測系統(tǒng)來源詳情

2.儀器 5個PETIA檢測系統(tǒng)(A～E系統(tǒng))和1個SPIA檢測系統(tǒng)(F系統(tǒng))均采用HITACHI 7600-110全自動生化分析儀，PENIA檢測系統(tǒng)應(yīng)用SIEMENS DADE BEHRING BNⅡ特定蛋白分析儀。

3.比對樣本 選取患者樣本46份，其Cys C濃度覆蓋整個可報告范圍，標(biāo)本無黃疸、溶血、乳糜等干擾。

4.輔助試劑 生理鹽水來自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的0.9%氯化鈉注射液(批號1107014W)，用于基礎(chǔ)空白測定和稀釋樣本;干擾物質(zhì)血紅蛋白(Hb)自配，將新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血離心，去除血漿，加生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，重復(fù)3次，再加去離子純水使之溶血，配制成Hb干擾物;醫(yī)用脂肪乳(C14-24)由西安力邦制藥有限公司提供(批號:11080S)，用生理鹽水稀釋成甘油三酯(TG)濃度為4、8、15、28 mmol/L的干擾物。

二、評價方法

參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)評價方案對檢測系統(tǒng)性能進(jìn)行評價。

1.精密度評估 參考CLSI EP5-A2文件［3］。選取患者新鮮血清，自行配制3個濃度(0.8、2.7、4.7 mg/L)的混合血清。批內(nèi)重復(fù)性:同一時間內(nèi)連續(xù)測定20次。批間重復(fù)性:連續(xù)測定10 d，每天測定2批，每批測定1次，2批間隔＞2 h。計算批內(nèi)、批間變異系數(shù)(CV)。根據(jù)美國臨床實驗室修正法案(CLIA'88)建議:批內(nèi)CV＜1/4總允許誤差(TEa)(即＜3.75%)，批間 CV＜1/3 TEa(即＜5%)［4-5］;基于 CLIA'88 對生物學(xué)變異設(shè)定的分析質(zhì)量指標(biāo)中建議Cys C的精密度應(yīng)達(dá)到的理想目標(biāo)為2.3%［6-8］。

2.正確度評估 參考 CLSI EP15-A2文件［9］。方法①:對歐洲Cys C有證參考物質(zhì)ERMDA471/IFCC［其靶值±不確定度為(5.48±0.15)mg/L］進(jìn)行檢測，分析與靶值之間的偏倚;方法②:對2011年度和2012年3月CAP發(fā)放的Cys C室間質(zhì)評物進(jìn)行測定。根據(jù)CLIA'88建議，TEa＜±15%［4-5］，基于 CLIA'88對生物學(xué)變異設(shè)定的分析質(zhì)量指標(biāo)中建議Cys C的偏倚和TEa應(yīng)達(dá)到的理想目標(biāo)分別為3.4%和7.2%［6-8］。

3.空白限(LoB) 參考 CLSI EP17-A文件［10］。以生理鹽水作為空白樣本，每天檢測2批，每批重復(fù)2次，連續(xù)5 d，共獲得20個結(jié)果。將實驗數(shù)據(jù)繪制成頻數(shù)分布圖，根據(jù)其分布類型再采用參數(shù)檢驗或非參數(shù)檢驗方法估計LoB。

4.抗干擾性評估 參考 CLSI EP7-A2文件［11］。收集低(0.8 mg/L)、高(7.3 mg/L)2 個濃度混合血清，在上述血清中加入Hb、TG干擾物，配制成Hb終濃度為10、13 g/L，TG終濃度為4、8、15、28 mmol/L的樣本，對照樣本加入等體積生理鹽水，每份樣本測定2次，取均值，以偏差＜±10%作為評判標(biāo)準(zhǔn)。

5.相關(guān)和偏差分析 參考CLSI EP9-A2文件［12］。各系統(tǒng)同時測定，每份樣本測定2次，取均值，以BNⅡ系統(tǒng)(PENIA)為參考，分析PETIA與PENIA間的相關(guān)性和偏差。相關(guān)系數(shù)(r)要求＞0.975。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)分析采用Microsoft Excel 2003、SPSS 13.0 及 Medcalc 11.6.1 軟件。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。偏差分析應(yīng)用Bland-Altman差異分析法。

結(jié) 果

一、精密度評估結(jié)果

當(dāng)Cys C 濃度為0.8～5.0 mg/L時，6個系統(tǒng)(A～F)和BNⅡ系統(tǒng)總批內(nèi)CV均＜3.75%，總批間CV除E系統(tǒng)外均＜5%，重復(fù)性良好;其中D系統(tǒng)的精密度符合CLIA'88建議的理想目標(biāo)(CV＜2.3%)。見表2、3。

二、正確度評估結(jié)果

1.A～E系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)測定ERM-DA471的絕對偏倚分別為0.00、0.00、1.01、－0.01、－0.50、－0.35 mg/L，相對偏倚分別為0%、0%、18.43%、－0.18%、－9.12%、－6.39%;F 系統(tǒng)未參與評估。其中A、B、D 3個系統(tǒng)符合CLIA'88建議達(dá)到的理想偏倚(3.4%)［6-8］。見表4。

表2 6個檢測系統(tǒng)(A～F)和BNⅡ系統(tǒng)的批內(nèi)精密度(%)

表3 6個檢測系統(tǒng)(A～F)和BNⅡ系統(tǒng)的批間精密度(%)

表4 A～E系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)測定ERM-DA471的結(jié)果

2.僅D系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)測定CAP室間質(zhì)評物的結(jié)果較為理想，滿足CLIA'88建議的理想目標(biāo)(TEa＜7.2%)［6-8］，其他系統(tǒng)均有 50% 的結(jié)果與CAP均值的相對偏倚超出CLIA'88建議的TEa(靶值±15%)。整體來看，PENIA測定結(jié)果低于PETIA。見表5。

三、空白限(LoB)實驗結(jié)果

A～F系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)的LoB分別為0.00、0.00、0.31、0.01、0.10、0.06和＜0.05 mg/L。

四、抗干擾性驗證結(jié)果

當(dāng)Hb≤13 g/L、TG≤28 mmol/L時對A、B系統(tǒng)及BNⅡ系統(tǒng)無影響(干擾＜±10%)。C系統(tǒng)在TG≥4 mmol/L時呈正干擾;D系統(tǒng)在TG≥28 mmol/L時對低水平Cys C呈負(fù)干擾;E系統(tǒng)在Hb≥10 g/L時對低水平Cys C呈負(fù)干擾;F系統(tǒng)在Hb≥10 g/L時對低水平Cys C呈正干擾，在TG≥15 mmol/L時對低水平Cys C呈負(fù)干擾。見表6。

表5 6個檢測系統(tǒng)(A～F)和BNⅡ系統(tǒng)測定CAP室間質(zhì)評物的結(jié)果 (mg/L)

表6 6個(A～F)檢測系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)抗干擾性驗證結(jié)果 (mg/L)

五、相關(guān)性和偏差分析

A～F系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的相關(guān)性較好，r分別為0.998、0.998、0.986、0.998、0.994、0.993，均＞0.975(P＜0.01)。Bland-Altman偏差分析顯示A～F系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的平均絕對偏差分別為－0.02、－0.10、－0.31、0.05、0.04、0.36 mg/L，平均百分偏差分別為－0.57%、2.58%、10.15%、4.92%、14.48%、8.06%。見圖1。

圖1 A～F系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的偏差分析

討 論

目前國內(nèi)Cys C測定方法多種多樣，原理各不相同。不同體系間的偏差導(dǎo)致以Cys C作為參數(shù)估算腎小球率過濾(eGFR)的方程多樣性，這是由于測定Cys C的校準(zhǔn)品不同，方法未一致化所造成的。因此Cys C的標(biāo)準(zhǔn)化問題受到高度重視，國際臨床化學(xué)和實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)成立了Cys C標(biāo)準(zhǔn)化工作組，工作組推薦將Cys C原級參考品添加到脫脂的人血清中，制備得到的次級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ERM-DA471/IFCC)具有良好的互通性。ERM-DA471在復(fù)溶物質(zhì)中使用顆粒增強(qiáng)膠乳散射比濁、顆粒增強(qiáng)膠乳透射比濁和酶促單向免疫擴(kuò)散3種方法來定量，有Dako、Roche Diagnostics、Siemens Healthcare Diagnostics 3 個檢測系統(tǒng)參與。該定值由4個實驗室各自檢測，由7個可接受均值的未加權(quán)均值確定。目前在國內(nèi)各系統(tǒng)之間測定ERM-DA471的正確度評估未見報道，國產(chǎn)Cys C試劑校準(zhǔn)品溯源不統(tǒng)一，校準(zhǔn)品賦值存在差異。為此，本研究選取國內(nèi)常見6種檢測系統(tǒng)在HITACHI系統(tǒng)進(jìn)行分析性能驗證，以期為臨床應(yīng)用提供信息。

正確度驗證顯示不同檢測系統(tǒng)之間存在著差異，測定ERM-DA471顯示PETIA法中 A、B、D 3個系統(tǒng)在可接受范圍，而C、E、BNⅡ系統(tǒng)均超出規(guī)定的不確定度，最大偏倚可達(dá)到1 mg/L，最大相對偏倚為18.43%，準(zhǔn)確性欠佳。檢測系統(tǒng)的性能需要進(jìn)一步改進(jìn)。為進(jìn)一步評價不同儀器檢測系統(tǒng)間是否存在差異，我們對CAP室間質(zhì)控物進(jìn)行分析，其靶值統(tǒng)計是采用所有參與實驗室按方法學(xué)或儀器分組計算中位數(shù)求得。按檢測儀器不同分為HITACHI/ROCHE全自動生化儀系列和SIEMENS特種蛋白儀系列，結(jié)果顯示采用HITACHI系列PETIA中僅D系統(tǒng)符合CLIA'88建議的理想TEa(7.2%)，SPIA也未能滿足要求;BNⅡ系統(tǒng)測定CAP質(zhì)控物偏倚雖然也在TEa(7.2%)允許范圍內(nèi)，但是其不同水平的測定結(jié)果均低于HITACHI/ROCHE系列檢測系統(tǒng)。

抗干擾性驗證顯示C系統(tǒng)在TG≥4 mmol/L時對低水平和高水平樣本均呈正干擾(干擾＞+10%)，可能與C系統(tǒng)使用單波長測定有關(guān)，使用單波長雖可提高檢測靈敏度，但不能消除脂血、乳糜帶來的濁度影響，建議C系統(tǒng)在測定脂血和乳糜血標(biāo)本時增加第2波長;F系統(tǒng)在Hb≥10 g/L時對低水平樣本呈正干擾(干擾＞+10%)，Hb≥13g/L時對高水平樣本呈正干擾(干擾＞+10%)，考慮F系統(tǒng)是采用SPIA，其反應(yīng)體系顏色的變化會影響Cys C的檢測，因此溶血對樣本測定影響較大。

6個系統(tǒng)(A～F)與BNⅡ系統(tǒng)相關(guān)性良好(r均＞0.975，P＜0.01)。Bland-Altman 差異分析顯示6個系統(tǒng)(A～F)與BNⅡ系統(tǒng)之間的平均偏差和平均百分偏差相差較大，與文獻(xiàn)［13］報道相符，其中C系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的平均偏差為－0.31 mg/L;Cys C濃度在5.0 mg/L 以上時與BNⅡ系統(tǒng)偏差較大，高濃度樣本檢測比實際濃度偏低，可能是由于鉤狀效應(yīng)的影響。當(dāng)抗原量過剩時而出現(xiàn)的后帶現(xiàn)象，導(dǎo)致免疫復(fù)合物的降低，應(yīng)當(dāng)稀釋樣本后重新進(jìn)行測定。這也說明C系統(tǒng)的檢測線性低于BNⅡ系統(tǒng)。F系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的平均偏差為0.36 mg/L，有研究報道顯示SPIA 與PENIA 有0.27 mg/L［14］或 32.7%［15］的正偏差，與本研究結(jié)論相似。其他4個系統(tǒng)(A、B、D、E)與BNⅡ系統(tǒng)的偏差相差不大，但E系統(tǒng)的百分偏差為14.48%，接近 CLIA'88建議的 TEa(靶值±15%)?？赡苁怯捎贓系統(tǒng)的空白限偏高(為0.1 mg/L)，導(dǎo)致 Cys C 在0.8 mg/L以下的低濃度時與BNⅡ系統(tǒng)比較的百分偏差較大。有報道顯示PETIA較PENIA有－0.16 mg/L的負(fù)偏差［16］，還有文獻(xiàn)［17］報道稱 PETIA 較 PENIA 有－0.009 mg/L 的負(fù)偏差，另有文獻(xiàn)［15］報道顯示PETIA較 PENIA有24.5%和27.6%的正偏差。這可能是由于市場上銷售的Cys C試劑廠家眾多，每種試劑中Cys C抗體的效價不同，尤其是各檢測體系的校準(zhǔn)品溯源不統(tǒng)一，校準(zhǔn)品賦值存在差異，造成產(chǎn)品差異很大，嚴(yán)重影響其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果采用準(zhǔn)確賦值的校準(zhǔn)品，有可能使不用檢測體系對同一份樣品的檢測結(jié)果基本一致。本研究的不足之處是未能采用ERM-DA471驗證各檢測體系校準(zhǔn)品賦值的準(zhǔn)確性。

綜上所述，A、B、D 3個系統(tǒng)的各項性能指標(biāo)基本滿足臨床試驗的要求;部分廠家Cys C檢測試劑的準(zhǔn)確性欠佳，且不同系統(tǒng)間結(jié)果存在一定偏差，是否可通過校正因子或統(tǒng)一校準(zhǔn)品進(jìn)行糾正，從而使檢測結(jié)果在不同系統(tǒng)間達(dá)到一致可比有待進(jìn)一步驗證。臨床應(yīng)用中，實驗室應(yīng)選用分析性能優(yōu)越的檢測系統(tǒng)，通過參加室間質(zhì)評或其他渠道驗證其正確度。

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