亢澤春 劉少華 高 聰(濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

酒精性肝病是一進(jìn)行性疾病，早期的病理改變?yōu)楦渭?xì)胞氧化損傷，一旦發(fā)展到晚期則難以逆轉(zhuǎn)和治愈。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗氧化、解酒等作用〔1，2〕。相關(guān)研究表明〔3〕，雞血藤提取物總黃酮有抗氧化及保肝作用。本實(shí)驗(yàn)以雞血藤總黃酮作為解酒及保肝劑，在構(gòu)建小鼠酒精性肝損傷模型基礎(chǔ)上，觀察雞血藤總黃酮的解酒及保肝作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重(25±2)g，濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào):20100009)。

1.2 試劑 雞血藤總黃酮(濱州醫(yī)學(xué)院藥物研究所提供，含量85%)，56%(v/v)二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)20101211、20101208、20101112;氯化鈉注射液(山東科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)091130);無水乙醇(煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)090730)。

1.3 儀器 IR16-A高速冷凍離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)，UV757CRT紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，BS-200全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 取小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為5組:空白組、模型組、雞血藤總黃酮低、中、高劑量組，每組12只?？瞻捉M給予生理鹽水20 ml/kg，1次/d，雞血藤總黃酮?jiǎng)┝糠謩e為0.1、0.2、0.4 g/kg;模型組20 ml/kg生理鹽水。均連續(xù)灌胃給藥7 d。

1.4.2 急性酒精性肝損傷造模 除空白組外，其余各組均在末次給藥1 h后，一次性給予56%(v/v)的紅星二鍋頭酒10 ml/kg?？瞻捉M給予等量的生理鹽水灌胃。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)定及方法 記錄小鼠的耐受酒精時(shí)間(從灌酒到翻正反射消失)和醉酒時(shí)間(從翻正反射消失到翻正反射重新開始)，比較各組間的差異。小鼠禁食16 h后，摘除眼球取血，離心血清，應(yīng)用BS-200全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，總膽紅素(TB)含量。取小鼠肝臟，用冷生理鹽水沖洗后制備勻漿，離心后取上清，測(cè)定SOD，GSH-Px及MDA活性，參照試劑盒說明書操作。取小鼠肝臟，用10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。取小鼠肝臟，胰酶消化后低溫高速離心機(jī)離心得肝細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)肝細(xì)胞線粒體膜電位。取10%肝組織勻漿，低溫低速離心沉淀后，將上清低溫高速離心15 min，得沉淀即為線粒體，參照文獻(xiàn)方法測(cè)定線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體?+ó、ò+ó活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.1統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠酒精耐受時(shí)間和醉酒昏睡時(shí)間的影響 高劑量雞血藤總黃酮組小鼠酒精耐受時(shí)間較模型組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而低、中劑量組與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);雞血藤總黃酮各劑量組均可明顯縮短醉酒時(shí)間(P＜0.01)。見表1。

2.2 對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響 與空白組相比，模型組小鼠ALT，AST，TB含量均明顯升高(P＜0.01);雞血藤總黃酮高、中劑量組ALT，AST，TB含量與模型組相比明顯降低(P＜0.01)。見表2。

表1 雞血藤總黃酮對(duì)小鼠醉酒時(shí)間和耐受時(shí)間的比較( s，n=12，min)

表1 雞血藤總黃酮對(duì)小鼠醉酒時(shí)間和耐受時(shí)間的比較( s，n=12，min)

與模型組比較:1)P＜0.01

耐受時(shí)間 醉酒時(shí)間空白組組別 死亡數(shù)(n)0--模型組 4 13.10±3.13 156.63±16.12雞血藤總黃酮高劑量組 3 23.25±5.751)112.22±14.291)雞血藤總黃酮中劑量組 2 19.33±11.05 124.90±13.73雞血藤總黃酮低劑量組4 18.45±8.07 132.50±14.74

表2 雞血藤總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清肝功能指標(biāo)的影響( s，n=12)

表2 雞血藤總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清肝功能指標(biāo)的影響( s，n=12)

與空白組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，下表同

組別 ALT(IU/L)AST(IU/L)TB(μmol/L)34.69±10.81 49.57±15.23 9.21±4.07模型組 208.02±25.061)452.60±157.811)55.67±24.461)雞血藤總黃酮高劑量組 100.74±11.172)213.37±90.272)30.88±12.362)中劑量組 135.86±32.272)320.64±104.512)37.19±9.542)低劑量組空白組197.78±20.01 387.16±125.29 49.23±20.03

2.3 對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 模型組SOD，GSH-Px活性和 MDA水平與空白組相比，差異顯著(P＜0.01)。與模型組相比，雞血藤總黃酮中、高劑量組SOD，GSH-Px活性明顯升高(P＜0.01)，MDA水平明顯降低(P＜0.01)。見表3。

2.4 對(duì)小鼠肝臟組織學(xué)病理變化的影響 光鏡下觀察到空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常;模型組可見肝索紊亂、胞質(zhì)疏松，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一的脂滴空泡，竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、增生，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死;雞血藤總黃酮各給藥組小鼠肝組織也見肝細(xì)胞變化，但程度較模型組明顯減輕。見圖1。

表3 雞血藤總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激的影響( s，n=12)

表3 雞血藤總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激的影響( s，n=12)

組別SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)MDA(nmol/mg)193.68±21.20 12.98±3.21 3.18±0.61模型組 92.20±10.401)6.62±2.831)10.49±2.051)雞血藤總黃酮高劑量組 180.54±17.172)11.44±4.452)6.73±1.102)雞血藤總黃酮中劑量組 162.45±18.132)9.22±2.072)7.94±1.122)雞血藤總黃酮低劑量組空白組109.04±25.07 7.39±2.75 9.01±1.59

圖1 雞血藤總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響(HE，×400)

2.5 對(duì)小鼠線粒體酶和線粒體膜電位的影響 與空白組相比，模型組小鼠呼吸鏈酶復(fù)合體?+ó、ò+ó活性顯著下降(P＜0.01)。與模型組相比，雞血藤總黃酮高中劑量組能明顯提高小鼠呼吸鏈酶復(fù)合體?+ó、ò+ó活性(P＜0.01)。與空白組相比，模型組小鼠線粒體膜電位明顯下降(P＜0.01)。與模型組相比，雞血藤總黃酮高、中劑量組小鼠線粒體膜電位明顯升高(P＜0.01)。見表4。

表4 雞血藤總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠線粒體酶和線粒體膜電位的影響( s，n=12)

表4 雞血藤總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠線粒體酶和線粒體膜電位的影響( s，n=12)

組別 ?+ó ò+ó Δψm 11.68±1.21 21.93±2.33 1.00±0.09模型組 2.29±0.141) 4.26±0.831) 0.35±0.021)雞血藤總黃酮高劑量組 10.54±1.172) 11.44±4.452) 0.89±0.062)雞血藤總黃酮中劑量組 6.24±0.832) 9.22±2.072) 0.78±0.032)雞血藤總黃酮低劑量組空白組3.04±0.07 7.39±2.75 0.49±0.04

3 討論

長(zhǎng)期大量酒精攝入引起酒精性肝病的發(fā)生，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激在酒精性肝損傷中起著重要的作用。而引起肝損傷的氧化應(yīng)激是由自由基所誘導(dǎo)。自由基通過激活膜上的磷酸化酶或者攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子而使細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，也可通過與肝微粒體上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合而損傷膜結(jié)構(gòu)。而脂質(zhì)過氧化反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致線粒體細(xì)胞膜損傷，線粒體膜電位下降，線粒體內(nèi)酶活性下降〔4～6〕。SOD是重要的分布于生物體內(nèi)的抗氧化酶，發(fā)揮清除體內(nèi)氧自由基，防止細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的作用，SOD活性大小反映自由基的清除速度。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，反映脂質(zhì)過氧化程度，間接反映肝損傷的程度〔7〕。GSHPx反映機(jī)體抗氧化能力，它和SOD，過氧化氫酶(CAT)共同清除體內(nèi)的活性氧，從而減輕和阻止活性氧的損傷作用〔8〕。GSHPx不僅能清除過氧化氫和氫過氧化物，而且能夠使脂質(zhì)過氧化物(LPO)變成無毒的羥化物，防止細(xì)胞膜和其他細(xì)胞器免受過氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)說明應(yīng)用雞血藤總黃酮后，小鼠的肝氧化損傷程度減輕，雞血藤總黃酮對(duì)乙醇所致肝損傷有保護(hù)作用。ALT，AST是判斷肝損傷的重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用雞血藤總黃酮后，ALT，AST，TB水平較模型組明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)了雞血藤總黃酮的保肝作用。通過測(cè)定線粒體膜電位，觀察線粒體的完整性。而線粒體呼吸鏈上復(fù)合體的活性決定了線粒體的產(chǎn)能情況。復(fù)合體?和ó是電子傳遞入口，而復(fù)合體ó向下傳遞電子并伴隨能量的產(chǎn)生，故復(fù)合體?+ó和復(fù)合體ò+ó活性反映線粒體的功能。該實(shí)驗(yàn)中雞血藤總黃酮可提高線粒體膜電位并增強(qiáng)肝線粒體酶復(fù)合體?+ó、ò+ó活力。而雞血藤總黃酮對(duì)線粒體的保護(hù)作用又可能是由于其抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的活性，減少活性氧的產(chǎn)生。但雞血藤總黃酮保肝作用機(jī)制是否是與線粒體通路有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

1 謝 玲，黃海瀟，張 浩，等.基于抗氧化反應(yīng)元件的藥物篩選模型的建立〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006;22(12):1525.

2 Chow JM，Shen SC，Huan SK，et al.Quercetin，but not rutin and quercitin，prevention of H2O2-induced apoptosis via antioxidant activity and heme oxygenase 1 gene expression in macrophages〔J〕.Biochem Pharmacol，2005;69:1839.

3 劉俊林.雞血藤醇提物清除氧自由基的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.衛(wèi)生職業(yè)教育，2006;24(2):128.

4 鄧 源，班春林，武曉瓊.乙醇誘導(dǎo)肝損傷作用機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.華北國(guó)防醫(yī)藥，2005;17(4):242.

5 楊明杰，周建嫦，黃俊明，等.酒精性肝病發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)公共衛(wèi)生，2003;19(3):367.

6 劉 爽，姚 平，李 珂，等.槲皮素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精性氧化損傷的防護(hù)作用〔J〕.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2007;29(3):288.

7 潘春芬，肖秀華，田恩圣，等.雞血藤體外對(duì)肝勻漿MDA生成及蛋白質(zhì)糖基化作用〔J〕.中華醫(yī)學(xué)全科雜志，2004;3(3):26.

8 黃鎖義，羅建華，張麗丹，等.雞血藤總黃酮的提取及對(duì)羥自由基的清除作用研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007;18(9):3.