明海霞 賀志有 王香梅 王 嵐 侯 茜 張 帆 (甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730001)

近年來(lái)，對(duì)黃芪影響衰老相關(guān)基因、細(xì)胞凋亡、DNA損傷的修復(fù)及端粒長(zhǎng)度來(lái)延緩衰老的研究有所進(jìn)展〔1〕。郝春光等〔2〕運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，研究黃芪對(duì)快速老化鼠相關(guān)衰老基因表達(dá)的影響。這些研究方法，多以單一或少量幾個(gè)靶點(diǎn)的生物信息改變?yōu)檠芯繉?duì)象，對(duì)中藥多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，上述研究方法，則顯露出明顯的局限性，對(duì)此基因芯片技術(shù)卻是有益的補(bǔ)充。基因芯片技術(shù)具有高通量、并行性、低消耗、微型化和自動(dòng)化的特點(diǎn)，能夠高效、快速且多參量同時(shí)研究大量基因在不同刺激條件下表達(dá)的差異〔3〕。鑒于基因在衰老過(guò)程中的重要性及中藥作用的整體效應(yīng)，本研究采用D-半乳糖所致衰老模型小鼠，小鼠全基因組基因芯片，研究甘肅黃芪對(duì)衰老模型小鼠腦組織基因表達(dá)譜的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 黃芪水煎劑的制備:取黃芪100 g(甘肅岷縣黃芪，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥系教授張西玲鑒定)，切成片，加相當(dāng)于藥材量8倍的冷水浸泡2 h，煮沸30 min，濾過(guò);藥渣加6倍量水煮沸20 min，濾過(guò)。合并兩次煎出液，加熱濃縮至100 ml，即為100%黃芪水煎劑，其濃度相當(dāng)于生藥量1 g/ml，置4℃?zhèn)溆谩?〕。

1.2 試劑與儀器 D-半乳糖購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(產(chǎn)品編號(hào)D810-25);TRIzol(Invitrogen);RNasey Mini Kit(Qiagenp/n 74904);Baseline-ZERO Dnase (EPICENTRE，Cat.Nos.DB0711K);Agilent Gene Expression Hybridization Kit(Agilent p/n 5188-5242);NanoDrop ND-1000;Hybridization oven(Agilent p/n G2545A)Slide-staining dish，with sliderack(Thermo Shandon p/n 121);包含41000個(gè)基因的Agilent小鼠全基因組表達(dá)譜芯片(Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray 4×44K)Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)。

1.3 造模及分組 昆明種小鼠30只，2～3月齡，體重18～22 g，雌性，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，分籠群養(yǎng)，自由飲水、攝食，自然光照，室溫20℃ ～25℃，濕度45% ～55%。隨機(jī)分為3組，空白組、模型組、黃芪組，每組10只。除空白組外，其余各組每只頸背皮下注射5%D-半乳糖120 mg·kg－1·d－1，連續(xù) 6 w〔4〕，造成衰老模型?？瞻捉M頸背皮下注射同等劑量生理鹽水。造模的同時(shí)，空白組和模型組每只每天灌服生理鹽水0.5 ml，黃芪組小鼠按黃芪煎液18 g·kg－1·d－1灌胃 (相當(dāng)于 60 kg的成人臨床最大用量的12倍)。

1.4 標(biāo)本制備 連續(xù)給藥6 w后，于最后1 d灌胃和注射D-半乳糖2 h后，頸椎脫臼處死，立即取出腦組織，切取海馬區(qū)組織50～100 mg加入1 ml的TRIzol試劑用玻璃勻漿器勻漿，置－20℃冰箱備用。同時(shí)取肝組織測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，谷胱苷肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)，方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行(測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。

1.5 總RNA提取、純化 按Trizol(Invitrogen life technologies)法提取腦組織細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)異丙醇沉淀法濃縮RNA，并進(jìn)一步采用QIAGEN RNase試劑盒純化總RNA，詳細(xì)操作方法按試劑盒說(shuō)明，最后用分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。基因芯片試驗(yàn)，由上?？党缮锿瓿?。

1.6 掃描與分析 芯片掃描用美國(guó)安捷倫公司的基因芯片掃描儀，單色掃描，芯片數(shù)據(jù)通過(guò)安捷倫公司的影像分析轉(zhuǎn)換軟件(版本號(hào)10.5.1.1)把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，再通過(guò)GeneSpring GX軟件(版本號(hào)10.0)進(jìn)行后期數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化;最后以差異為2倍的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1 抗衰老小鼠模型的構(gòu)建 造模2 w后，模型組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、食量下降、行動(dòng)遲緩、毛發(fā)枯黃、失去光澤、皮膚松弛彈性下降等一系列的衰老癥狀，而藥物組、空白組則精神狀態(tài)良好、行動(dòng)敏捷、毛色白、光滑、皮膚彈性良好。經(jīng)過(guò)7 w的造模后這些癥狀更加明顯。與空白組比較，衰老模型組小鼠肝中MDA含量明顯增加，SOD、GSH-Px活性明顯降低;與模型組比較，黃芪組小鼠肝臟組織中MDA含量顯著降低(P＜0.01)，肝臟SOD活力和GSH-Px活力明顯增高(P＜0.01);表明黃芪水煎劑能顯著增高衰老小鼠肝臟中SOD、GSH-PX活力和降低MDA含量，有明顯抗氧化作用，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道說(shuō)明此次造模是成功的〔5〕。見(jiàn)表1。

表1 黃芪水煎劑對(duì)小鼠肝組織SOD，MDA，GSH-Px的影響( s，n=10)

表1 黃芪水煎劑對(duì)小鼠肝組織SOD，MDA，GSH-Px的影響( s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)GSH-Px(活力單位)空白組 128.55±23.851) 5.68±2.271) 33.62±8.651)模型組 100.09±19.69 10.98 ±3.81 21.65 ±8.92黃芪組 129.41±20.651) 3.84±1.571) 34.29 ±7.801)

2.2 不同組小鼠腦組織總RNA提取、純化質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀(guān)察并拍照，結(jié)果顯示(圖1)，28 S和18 S核糖體RNA的帶非常亮而濃，兩個(gè)條帶間的亮度之比基本符合2∶1。還觀(guān)察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其他異型RNA組成。

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm、280 nm和230 nm的吸光度(OD)值，通過(guò)計(jì)算得出:(1)OD260/OD280＞1.96，說(shuō)明蛋白質(zhì)污染極少;(2)OD260/OD230＞1.97，說(shuō)明異硫氰酸胍等鹽類(lèi)污染極少;(3)按照1OD260=40 μg RNA/ml計(jì)算，各組總體RNA產(chǎn)率接近，大約都在2 μg RNA/mg組織。從照片和OD值分析，所得總體RNA的純度和完整性均較好，適宜進(jìn)行mRNA純化及雜交分析。

2.3 芯片掃描圖 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求對(duì)所提取的3組小鼠腦組織RNA樣品在3張包含41 000個(gè)基因的Agilent小鼠全基因組表達(dá)譜芯片(Agilent Whole Mouse Genome OligoMicroarray 4×44 K)上分別進(jìn)行雜交后，基因芯片掃描圖如下(圖2，本試驗(yàn)為單色Cy3標(biāo)記)每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因的表達(dá)，亮度越高就代表表達(dá)量越高，不同位置代表不同探針。根據(jù)不同的亮度顯示應(yīng)用專(zhuān)業(yè)的掃描軟件進(jìn)行表達(dá)量的對(duì)比，篩選出差異基因。右側(cè)上圖是芯片左上角、下圖是中間部分掃描圖的放大。

2.4 差異表達(dá)基因的分析 黃芪組與模型組比較有3 744個(gè)差異表達(dá)基因，其中2 235個(gè)表達(dá)上調(diào)，1 509個(gè)表達(dá)下調(diào);黃芪組與空白組比較有2 771個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 576個(gè)表達(dá)上調(diào)，1 195個(gè)表達(dá)下調(diào);模型組與空白組比較有924個(gè)差異表達(dá)基因，其中454個(gè)表達(dá)上調(diào)，470個(gè)表達(dá)下調(diào)。

通過(guò)比較分析模型組與空白組、黃芪組與空白組、黃芪組與模型組差異表達(dá)的基因，獲得在衰老小鼠中，表達(dá)水平受黃芪用藥影響的基因。對(duì)模型組與空白組比較，篩選出29個(gè)基因，其中未知基因14個(gè)，已知基因15個(gè)，上調(diào)基因5個(gè)，下調(diào)基因10個(gè)。這15個(gè)基因，在黃芪組中有4個(gè)表達(dá)與模型組一致，11個(gè)表達(dá)有顯著差異。見(jiàn)表2。

表2 與空白組比較在模型組和黃芪組表達(dá)有顯著差異的部分基因列表

對(duì)黃芪組與空白組比較，另外篩選出21個(gè)只在黃芪組表達(dá)的基因，其中未知基因8個(gè)，已知基因13個(gè)，上調(diào)基因9個(gè)，下調(diào)基因4個(gè)〔6〕。見(jiàn)表3。

表3 只在黃芪組表達(dá)的部分差異基因列表

3 討論

本文篩選出15個(gè)與衰老相關(guān)的基因，其中4個(gè)在黃芪組與模型組表達(dá)一致，11個(gè)表達(dá)有顯著差異，另外，篩選出13個(gè)只在黃芪組中有明顯表達(dá)差異的基因，這些基因與衰老沒(méi)有直接的相關(guān)性，但可能與黃芪延緩衰老的作用機(jī)制有關(guān)〔7，8〕。

在本實(shí)驗(yàn)中，與衰老有關(guān)的15個(gè)基因參與的生物學(xué)過(guò)程，主要有:細(xì)胞的代謝過(guò)程，免疫應(yīng)答，生物大分子的修飾，蛋白質(zhì)的磷酸化，蛋白質(zhì)的運(yùn)輸，DNA的轉(zhuǎn)錄，對(duì)DNA損傷的應(yīng)答，細(xì)胞的生物合成，離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞骨架，細(xì)胞連接，神經(jīng)原細(xì)胞突軸的發(fā)育;細(xì)胞通訊，神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，髓鞘的形成，神經(jīng)細(xì)胞的分化、凋亡等;表明經(jīng)D-半乳糖作用后，小鼠表現(xiàn)出以上生物學(xué)功能的衰退。經(jīng)黃芪治療后，涉及以上生物學(xué)過(guò)程的基因表達(dá)發(fā)生改變，表明黃芪對(duì)衰老治療的機(jī)制可能是通過(guò)干預(yù)衰老相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控進(jìn)行的。另外，通過(guò)黃芪組與空白組比較，篩選出13個(gè)只在黃芪組中有明顯表達(dá)差異的基因，這些基因與衰老沒(méi)有直接的相關(guān)性，但它們涉及以下生物學(xué)功能:細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，核酸的生物合成，DNA損傷的修復(fù)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，微管的形成，促進(jìn)細(xì)胞的代謝活動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，參與神經(jīng)元的分化及發(fā)育，腦的發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程，這些基因在黃芪組與空白組中表達(dá)有明顯差異，而在模型組沒(méi)有表達(dá)，我們認(rèn)為，黃芪可能通過(guò)對(duì)這些基因表達(dá)的調(diào)控，延緩衰老。從延緩衰老的基因水平現(xiàn)有研究進(jìn)展來(lái)看，延緩衰老作用并非是作用于單一基因，而是一極其復(fù)雜的生物過(guò)程，是一連串基因激活與阻抑，通過(guò)各自產(chǎn)物相互作用，與內(nèi)、外環(huán)境交互影響的結(jié)果。這些研究從不同角度提出了延緩衰老的機(jī)制，但是對(duì)于延緩衰老來(lái)說(shuō)所要解決的問(wèn)題還很多，需要我們?cè)诂F(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上多途徑，多角度地探索。

本文結(jié)果表明黃芪通過(guò)多途徑、多層次、多靶點(diǎn)的整體調(diào)整作用，改善DNA修復(fù)功能，糾正凋亡調(diào)控機(jī)制的紊亂，促進(jìn)組織的修復(fù)，同時(shí)改善了信號(hào)的傳遞，并從基因轉(zhuǎn)錄水平反映了黃芪的整體良性調(diào)整作用。對(duì)于這些基因與衰老程度的關(guān)系以及和黃芪用藥的線(xiàn)性關(guān)系的進(jìn)一步深入研究，還需定量PCR技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)，給出定量關(guān)系，為揭示黃芪抗衰老的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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