孟 馨 王滌非 曹艷麗 張 錦 (中國醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院內分泌科，遼寧 沈陽 110001)

糖尿病患者大血管動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生率明顯高于非糖尿病人群。研究證實高血糖所致的血管內皮功能紊亂是糖尿病大血管并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素〔1〕，脂聯(lián)素是一種具有胰島素增敏代謝效應和血管保護作用的脂肪細胞來源的血漿蛋白〔2，3〕。糖尿病合并心血管病變患者脂聯(lián)素水平明顯低于糖尿病但無心血管病變者，提示脂聯(lián)素可能在糖尿病粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Ouedraogo等〔4〕研究結果顯示人脂聯(lián)素的重組球形區(qū)域可降低高糖誘導的內皮活性氧自由基的產生。本研究以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞為模型，探討球形脂聯(lián)素(gAd)對高糖誘導血管內皮細胞巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)mRNA表達的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 gAdAPN、D-葡萄糖、cAMP/PKA抑制劑 H-89(美國Sigma公司);RPMI1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司);Trizol逆轉錄試劑盒試劑購自美國Gibco公司;MIP-1α引物由上海生物工程有限公司合成;DNA marker購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng)及鑒定 PBS沖洗新生兒臍帶靜脈腔，0.25%的胰蛋白酶后收集內皮細胞懸液，離心后用150 mg/L內皮細胞生長添加物、75 μmol/L肝素、20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液吹打接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱內培養(yǎng)，融合后予0.125%的胰蛋白酶、0.02%EDTA消化傳代，第2～3代用于實驗。細胞經(jīng)Ⅷ因子相關抗原免疫熒光染色鑒定。

1.3 實驗分組 待細胞生長至亞融合狀態(tài)時，改用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，PBS洗滌細胞3次，進行下列分組處理:(1)用含不同濃度(5.6、11.1及22 mmol/L)葡萄糖的培養(yǎng)液對內皮細胞體外培養(yǎng)6 h;(2)gAd 100 nmol/L作用30 min后再加入22 mmol/L葡萄糖作用內皮細胞6 h;(3)H-89 1 μmol/L預處理15 min，予gAd 100 nmol/L作用30 min后再加入22 mmol/L葡萄糖作用內皮細胞6 h;(4)予以相同濃度及作用時間甘露醇作為對照組。每組實驗重復3次。

1.4 RT-PCR檢測內皮細胞內MIP-1α mRNA的表達 用Trizol試劑提取各組細胞總RNA。取各組細胞總RNA各1 μg逆轉錄成 cDNA，再取 2 μl cDNA進行 PCR循環(huán)，94℃ 變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35 個循環(huán)，末次延伸72℃10 min，4℃ 儲存。MIP-1α 引物序列為:正鏈5'-CTGCCCTTGCTGTCCTCCTCTG-3'，負 鏈 5'-CTGCCGGCTTCGCTTGGTTA-3'，PCR擴增產物長度為197 bp;β-actin引物序列為:正鏈 5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'， 負 鏈 5'-CATCTCTTGGTCGAAGTCCA-3'，擴增產物長度為 308 bp。反應產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，應用凝膠成像系統(tǒng)(美國αinnotach公司IS5500型)分析軟件測定條帶吸光度值，計算MIP-1α/β-actin積分吸光度比值。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS11.0進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均以s表示，組間差異顯著性比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 高糖對血管內皮細胞表達MIP-1α mRNA表達的影響人臍靜脈內皮細胞在倒置顯微鏡下呈鋪路石狀貼壁生長，予不同濃度葡萄糖處理內皮細胞后，用RT-PCR檢測MIP-1α mRNA表達水平。電泳結果顯示，葡萄糖濃度在5.6～22 mmol/L范圍內，MIP-1α mRNA的表達隨葡萄糖濃度的增高而明顯增加，22 mmol/L葡萄糖處理后內皮細胞MIP-1α mRNA的表達最高，且呈劑量依賴方式(P＜0.05);平均積分光密度值分析顯示，各組內皮細胞內MIP-1α mRNA的表達量分別為5.6 mmol/L葡萄糖組的1.87倍及2.64倍。見圖1。

2.2 gAd對高糖誘導的血管內皮細胞表達MIP-1α mRNA表達的影響 100 nmol/L gAd干預內皮細胞后，內皮細胞MIP-1α mRNA的表達下降，平均積分光密度值分析顯示MIP-1α mRNA的表達量降至5.6 mmol/L葡萄糖組的1.96倍;cAMP/PKA抑制劑H-89部分阻斷了gAd對高糖誘導的血管內皮細胞MIP-1α mRNA產生的抑制，平均積分光密度值分析顯示 MIP-1α mRNA的表達增加為5.6 mmol/L葡萄糖組的2.35倍(P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組內皮細胞內MIP-1α mRNA的表達

3 討論

血管內皮細胞的結構和功能紊亂是AS的始動因素。MIP-1α，一種屬于趨化因子CC亞家族的單核細胞/巨噬細胞趨化因子，可由血管內皮細胞、平滑肌細胞及單核細胞等產生。研究表明，MIP-1α可顯著增加單核細胞黏附于血管內皮細胞，在單核細胞黏附于血管壁進而侵入內膜下間隙轉變?yōu)榫奘杉毎淌芍|中起著重要作用〔5〕。糖尿病大血管并發(fā)癥的病理改變是動脈粥樣硬化，但與非糖尿病患者相比致殘率和致死率明顯增高，嚴重影響患者的生存質量和壽命。我們前期研究顯示，高血糖以時間及劑量依賴方式促進血管內皮細胞表達MIP-1α〔6〕，從而參與糖尿病 AS 的形成。

近幾年脂肪組織因其具有的內分泌功能而受到廣泛關注，而作為脂肪細胞因子之一的脂聯(lián)素成為了內分泌領域研究的熱點。1995年Scherer等〔7〕首先發(fā)現(xiàn)脂肪細胞分泌的一種類似于補體成分C1q的一種分泌型血漿蛋白質。脂聯(lián)素結構包含有4個結構域:氨基端的信號序列、可變區(qū)、膠原樣區(qū)、羧基端球狀區(qū)，其中gAd是脂聯(lián)素主要的功能結構域，比全長脂聯(lián)素具有更強的生物學作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度的脂聯(lián)素通過激活cAMP依賴的蛋白激酶A劑量依賴性地抑制TNF-α誘導的單核細胞對內皮細胞的黏附及NF-κB的活化，從而阻斷內皮細胞的炎性過程。這些結果表明，脂聯(lián)素可能通過cAMP/PKA和NF-κB通路調節(jié)內皮細胞的炎癥信號的轉導。此外，脂聯(lián)素尚可通過抑制A型清道夫受體的表達，降低oxLDL的攝入，抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉化〔8〕。由此可以推測，脂聯(lián)素可通過抑制慢性炎癥反應而保護血管內皮細胞功能。

目前有關脂聯(lián)素對葡萄糖濃度誘導內皮細胞表達MIP-1α影響的研究鮮有報道。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在一定葡萄糖濃度范圍內，隨葡萄糖濃度的增高，葡萄糖以劑量依賴方式促進血管內皮細胞MIP-1α mRNA的表達;gAd顯著減輕了對高糖誘導的血管內皮細胞MIP-1α mRNA的產生;cAMP/PKA抑制劑H-89部分阻斷了gAd對高糖誘導的血管內皮細胞MIP-1α mRNA產生的抑制。我們的研究表明，gAd可能通過抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞MIP-1α的表達，從而下調單核細胞向內皮細胞的趨化黏附，其中涉及的信號轉導通路部分經(jīng)由cAMP/PKA途徑，為糖尿病大血管并發(fā)癥的深入研究提供新的理論依據(jù)，也為臨床上治療糖尿病AS的防治提供了新的思路和藥物治療靶點。

1 The DCCT/EDIC Study Research Group.Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes〔J〕.N Engl J Med，2005;353(25):2643-53.

2 Goldstein BJ，Scalia R.Adiponectin:a novel adipokine linking adipocytes and vascular function〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004;89(6):2563-8.

3 Hug C，Lodish HF.The role of the adipocyte hormone adiponectin in cardiovascular disease〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2005;5(2):129-34.

4 Ouedraogo R，Wu XD，Xu SQ，et al.Adiponectin suppression of high-glucose-induced reactive oxygen species in vascular endothelial cells〔J〕.Diabetes，2006;55(6):1840-6.

5 Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease〔J〕.N Engl J Med，1999;340(2):115-26.

6 孟 馨，張 錦，滕 穎，等.葡萄糖濃度對血管內皮細胞表達巨噬細胞炎性蛋白1αmRNA及蛋白的影響〔J〕.中國醫(yī)科大學學報，2004;33(6):514-6.

7 Scherer PE，Williams S，F(xiàn)ogliano M，et al.A novel serum protein similar to C1q produced exclusively in adipocytes〔J〕.J Biol Chem，1995;270(45):26746-9.

8 Ouchi N，Kihara S，Arita Y，et al.Adipocyte-derived plasma protein，adiponectin，suppresses lipid accumulation and class.A scavenger receptor expression in human monocyte-derived macrophages〔J〕.Circulation，2001;103(8):1057-63.