孟 馨 王滌非 曹艷麗 張 錦 (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

糖尿病患者大血管動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生率明顯高于非糖尿病人群。研究證實(shí)高血糖所致的血管內(nèi)皮功能紊亂是糖尿病大血管并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素〔1〕，脂聯(lián)素是一種具有胰島素增敏代謝效應(yīng)和血管保護(hù)作用的脂肪細(xì)胞來(lái)源的血漿蛋白〔2，3〕。糖尿病合并心血管病變患者脂聯(lián)素水平明顯低于糖尿病但無(wú)心血管病變者，提示脂聯(lián)素可能在糖尿病粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Ouedraogo等〔4〕研究結(jié)果顯示人脂聯(lián)素的重組球形區(qū)域可降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮活性氧自由基的產(chǎn)生。本研究以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為模型，探討球形脂聯(lián)素(gAd)對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)mRNA表達(dá)的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 gAdAPN、D-葡萄糖、cAMP/PKA抑制劑 H-89(美國(guó)Sigma公司);RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);Trizol逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;MIP-1α引物由上海生物工程有限公司合成;DNA marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 PBS沖洗新生兒臍帶靜脈腔，0.25%的胰蛋白酶后收集內(nèi)皮細(xì)胞懸液，離心后用150 mg/L內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物、75 μmol/L肝素、20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液吹打接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，融合后予0.125%的胰蛋白酶、0.02%EDTA消化傳代，第2～3代用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色鑒定。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 待細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)，改用無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，PBS洗滌細(xì)胞3次，進(jìn)行下列分組處理:(1)用含不同濃度(5.6、11.1及22 mmol/L)葡萄糖的培養(yǎng)液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)6 h;(2)gAd 100 nmol/L作用30 min后再加入22 mmol/L葡萄糖作用內(nèi)皮細(xì)胞6 h;(3)H-89 1 μmol/L預(yù)處理15 min，予gAd 100 nmol/L作用30 min后再加入22 mmol/L葡萄糖作用內(nèi)皮細(xì)胞6 h;(4)予以相同濃度及作用時(shí)間甘露醇作為對(duì)照組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MIP-1α mRNA的表達(dá) 用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA。取各組細(xì)胞總RNA各1 μg逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再取 2 μl cDNA進(jìn)行 PCR循環(huán)，94℃ 變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)，末次延伸72℃10 min，4℃ 儲(chǔ)存。MIP-1α 引物序列為:正鏈5'-CTGCCCTTGCTGTCCTCCTCTG-3'，負(fù) 鏈 5'-CTGCCGGCTTCGCTTGGTTA-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為197 bp;β-actin引物序列為:正鏈 5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'， 負(fù) 鏈 5'-CATCTCTTGGTCGAAGTCCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 308 bp。反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)αinnotach公司IS5500型)分析軟件測(cè)定條帶吸光度值，計(jì)算MIP-1α/β-actin積分吸光度比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以s表示，組間差異顯著性比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MIP-1α mRNA表達(dá)的影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈鋪路石狀貼壁生長(zhǎng)，予不同濃度葡萄糖處理內(nèi)皮細(xì)胞后，用RT-PCR檢測(cè)MIP-1α mRNA表達(dá)水平。電泳結(jié)果顯示，葡萄糖濃度在5.6～22 mmol/L范圍內(nèi)，MIP-1α mRNA的表達(dá)隨葡萄糖濃度的增高而明顯增加，22 mmol/L葡萄糖處理后內(nèi)皮細(xì)胞MIP-1α mRNA的表達(dá)最高，且呈劑量依賴方式(P＜0.05);平均積分光密度值分析顯示，各組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MIP-1α mRNA的表達(dá)量分別為5.6 mmol/L葡萄糖組的1.87倍及2.64倍。見(jiàn)圖1。

2.2 gAd對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MIP-1α mRNA表達(dá)的影響 100 nmol/L gAd干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞MIP-1α mRNA的表達(dá)下降，平均積分光密度值分析顯示MIP-1α mRNA的表達(dá)量降至5.6 mmol/L葡萄糖組的1.96倍;cAMP/PKA抑制劑H-89部分阻斷了gAd對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞MIP-1α mRNA產(chǎn)生的抑制，平均積分光密度值分析顯示 MIP-1α mRNA的表達(dá)增加為5.6 mmol/L葡萄糖組的2.35倍(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MIP-1α mRNA的表達(dá)

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能紊亂是AS的始動(dòng)因素。MIP-1α，一種屬于趨化因子CC亞家族的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞趨化因子，可由血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及單核細(xì)胞等產(chǎn)生。研究表明，MIP-1α可顯著增加單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在單核細(xì)胞黏附于血管壁進(jìn)而侵入內(nèi)膜下間隙轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞吞噬脂質(zhì)中起著重要作用〔5〕。糖尿病大血管并發(fā)癥的病理改變是動(dòng)脈粥樣硬化，但與非糖尿病患者相比致殘率和致死率明顯增高，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和壽命。我們前期研究顯示，高血糖以時(shí)間及劑量依賴方式促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MIP-1α〔6〕，從而參與糖尿病 AS 的形成。

近幾年脂肪組織因其具有的內(nèi)分泌功能而受到廣泛關(guān)注，而作為脂肪細(xì)胞因子之一的脂聯(lián)素成為了內(nèi)分泌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。1995年Scherer等〔7〕首先發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞分泌的一種類似于補(bǔ)體成分C1q的一種分泌型血漿蛋白質(zhì)。脂聯(lián)素結(jié)構(gòu)包含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域:氨基端的信號(hào)序列、可變區(qū)、膠原樣區(qū)、羧基端球狀區(qū)，其中g(shù)Ad是脂聯(lián)素主要的功能結(jié)構(gòu)域，比全長(zhǎng)脂聯(lián)素具有更強(qiáng)的生物學(xué)作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度的脂聯(lián)素通過(guò)激活cAMP依賴的蛋白激酶A劑量依賴性地抑制TNF-α誘導(dǎo)的單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及NF-κB的活化，從而阻斷內(nèi)皮細(xì)胞的炎性過(guò)程。這些結(jié)果表明，脂聯(lián)素可能通過(guò)cAMP/PKA和NF-κB通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，脂聯(lián)素尚可通過(guò)抑制A型清道夫受體的表達(dá)，降低oxLDL的攝入，抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化〔8〕。由此可以推測(cè)，脂聯(lián)素可通過(guò)抑制慢性炎癥反應(yīng)而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。

目前有關(guān)脂聯(lián)素對(duì)葡萄糖濃度誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MIP-1α影響的研究鮮有報(bào)道。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在一定葡萄糖濃度范圍內(nèi)，隨葡萄糖濃度的增高，葡萄糖以劑量依賴方式促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞MIP-1α mRNA的表達(dá);gAd顯著減輕了對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞MIP-1α mRNA的產(chǎn)生;cAMP/PKA抑制劑H-89部分阻斷了gAd對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞MIP-1α mRNA產(chǎn)生的抑制。我們的研究表明，gAd可能通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MIP-1α的表達(dá)，從而下調(diào)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的趨化黏附，其中涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路部分經(jīng)由cAMP/PKA途徑，為糖尿病大血管并發(fā)癥的深入研究提供新的理論依據(jù)，也為臨床上治療糖尿病AS的防治提供了新的思路和藥物治療靶點(diǎn)。

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6 孟 馨，張 錦，滕 穎，等.葡萄糖濃度對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞炎性蛋白1αmRNA及蛋白的影響〔J〕.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004;33(6):514-6.

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8 Ouchi N，Kihara S，Arita Y，et al.Adipocyte-derived plasma protein，adiponectin，suppresses lipid accumulation and class.A scavenger receptor expression in human monocyte-derived macrophages〔J〕.Circulation，2001;103(8):1057-63.