劉世雄 劉世寶 趙 麗 嚴(yán) 祥 王 晶 (蘭州大學(xué)第一醫(yī)院老年科，甘肅 蘭州 730000)

糖尿病患者往往伴有胃腸動(dòng)力障礙，多表現(xiàn)為胃腸排空延遲、蠕動(dòng)減慢，但其病理機(jī)制至今尚未完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)心房利鈉多肽(ANP)廣泛存在于胃腸道并參與調(diào)節(jié)胃腸道的吸收、分泌和運(yùn)動(dòng)〔1，2〕。血糖升高后ANP的分泌也會(huì)增加，然而糖尿病胃腸動(dòng)力障礙是否與ANP的變化有關(guān)目前尚不清楚。本文探討ANP在血漿和胃竇平滑肌的變化并分析其與胃腸排空延遲的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立和分組 8周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只(購(gòu)自蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重約180 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、單純肥胖組和糖尿病組。對(duì)照組喂以常規(guī)飼料，飲用自來(lái)水，單純肥胖組、糖尿病組大鼠喂以高糖高脂飼料(豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鈉1%，常規(guī)飼料66.5%)，飲用120 g/L果糖水。喂養(yǎng)8 w測(cè)定體質(zhì)量、血糖后，禁食不禁水12 h，糖尿病組腹腔一次性注射30 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，對(duì)照組、單純肥胖組腹腔注入同等體積的枸櫞酸緩沖液。繼續(xù)喂養(yǎng)4 w，糖尿病組大鼠以空腹血糖大于16.7 mmol/L為造模成功。成模后對(duì)照組、單純肥胖組大鼠分別為8、11只，糖尿病組為13只。

1.2 胃腸排空的測(cè)定 12 w后大鼠禁食不禁水24 h，再次稱體重、測(cè)血糖后用濃度為0.5 mg/ml的5%葡萄糖酚紅溶液1.5 ml灌胃，灌胃后30 min后處死大鼠，打開腹腔，快速結(jié)扎賁門、幽門和回盲部，分離胃、小腸，并將小腸拉直后分為近(40%)、中(30%)、遠(yuǎn)(30%)三部分。分別剖開胃、小腸各段，以蒸餾水沖洗內(nèi)容物，定容為20 ml，而后加入0.5 mol/L氫氧化鈉20 ml攪拌混勻，靜置后取5 ml上清液加入三氯乙酸去蛋白，3 500 r/min 4℃離心10 min。取上清液用分光光度計(jì)在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。另取酚紅溶液先后加入蒸餾水、氫氧化鈉、三氯乙酸攪拌混勻，測(cè)定吸光度值為標(biāo)準(zhǔn)酚紅吸光度值。按下式計(jì)算各段酚紅殘留率:酚紅殘留率(%)=(各段酚紅殘留量/胃腸內(nèi)酚紅總殘留量)×100%。

1.3 放免法測(cè)定血漿ANP濃度 在0、8、12 w分次采血，取血漿放入－70℃冰箱保存?zhèn)錂z。試劑盒由解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所提供。

1.4 胃竇肌層ANP陽(yáng)性細(xì)胞光密度的測(cè)定 取大鼠胃竇-幽門處胃組織固定、包埋后切片、染色，計(jì)算機(jī)輔助圖像分析觀察胃竇平滑肌層中陽(yáng)性細(xì)胞的染色及分布情況并得到陽(yáng)性表達(dá)光密度，取同期大鼠心臟切片設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 8 w后單純肥胖組和糖尿病組大鼠體質(zhì)量較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)，糖尿病組和單純肥胖組之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。單純肥胖組和糖尿病組血糖有所增高，但與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。注射STZ或枸櫞酸緩沖液4 w后，糖尿病組大鼠血糖水平升高達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，與對(duì)照組及單純肥胖組比較差異有顯著意義(P＜0.05)。單純肥胖組與對(duì)照組比較血糖水平差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.2 胃腸排空的變化 見圖1，灌胃后30 min糖尿病組大鼠胃和近段小腸內(nèi)酚紅殘留率均多于對(duì)照組和單純肥胖癥(P＜0.05)，而中段和遠(yuǎn)段小腸酚紅殘留率均少于對(duì)照組和單純肥胖癥(P＜0.05);對(duì)照組和單純肥胖癥胃和小腸各段酚紅殘留率兩組比較無(wú)意義(P﹥0.05)。

2.3 血漿ANP的變化 見表1，與對(duì)照組和單純肥胖組相比，8 w后糖尿病組血漿ANP的濃度無(wú)變化，但12 w后ANP的濃度較對(duì)照組和單純肥胖組顯著升高(P＜0.05)。而對(duì)照組和單純肥胖組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 0、8、12 w各組大鼠體質(zhì)量、血糖及血漿ANP、胃竇肌層ANP陽(yáng)性細(xì)胞光密度值比較(s)

表1 0、8、12 w各組大鼠體質(zhì)量、血糖及血漿ANP、胃竇肌層ANP陽(yáng)性細(xì)胞光密度值比較(s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與單純肥胖組比較:2)P＜0.05

1.4 83.2±9.8 4.203±0.137單純肥胖組11174.46±10.71 359.86±22.76 459.28±29.03 5.70±1.42 7.05±0.92 7.98±0.77 81.3±11.5 86.2±9.6 84.7±10.1 4.981±0.075糖尿病組 13 175.46±9.97 361.75±22.03 461.92±22.851)5.49±0.86 7.86±1.91 21.37±2.421)2)78.4±9.2 82.2±7.4 124.1±11.91)2)8.227±1.0641)2)對(duì)照組 8 178.27±11.34 253.27±10.97 382.94±13.70 5.14±1.03 6.01±1.41 5.45±0.92 79.2±9.3 83.9±1

圖1 胃腸排空的變化

2.4 胃竇平滑肌層ANP陽(yáng)性細(xì)胞圖像分析光密度值比較見表1，在各組大鼠胃竇平滑肌層中均觀察到了ANP陽(yáng)性細(xì)胞，以肌間神經(jīng)叢中最為廣泛。在糖尿病組肌間神經(jīng)叢中ANP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組、單純肥胖組均明顯增高(P＜0.05)，光鏡下見神經(jīng)元胞體及神經(jīng)纖維普遍著色，呈棕黃色顆粒狀，胞漿著色，呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。而對(duì)照組、單純肥胖組ANP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)稀疏，神經(jīng)節(jié)密度較低，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，染色較淡呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照片在大鼠的胃神經(jīng)叢內(nèi)無(wú)棕黃色染色。

2.5 血漿ANP濃度、胃竇平滑肌層ANP陽(yáng)性細(xì)胞光密度值與血糖、胃腸各段酚紅殘留率的相關(guān)性分析 通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)12 w后糖尿病組大鼠血漿ANP濃度與近段小腸內(nèi)酚紅殘留率呈正相關(guān)(r=0.632，P=0.021)，而與胃、中段和遠(yuǎn)段小腸酚紅殘留無(wú)相關(guān)性(r=0.076，P=0.103);胃竇平滑肌層ANP陽(yáng)性細(xì)胞光密度值與胃內(nèi)酚紅殘留率呈正相關(guān)(r=0.591，P=0.035)，而與小腸各段酚紅殘留無(wú)相關(guān)性(r=0.168，P=0.197)。

3 討論

ANP具有強(qiáng)大的利鈉、利尿和拮抗腎素-醛固酮系統(tǒng)等作用，主要存在于哺乳動(dòng)物的心房肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在中樞水平ANP主要是通過(guò)參與副交感神經(jīng)來(lái)完成對(duì)胃腸功能的調(diào)節(jié)。除了受中樞神經(jīng)系統(tǒng)的支配外，還發(fā)現(xiàn)豚鼠的胃和小腸能合ANP并通過(guò)旁分泌和自分泌形式作用于胃腸道抑制胃腸運(yùn)動(dòng)，這種抑制效應(yīng)是通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)cGMP水平而實(shí)現(xiàn)的〔3〕。通過(guò)前期的研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死大鼠胃排空延遲與血漿ANP濃度升高有關(guān)〔4〕，同胃動(dòng)素、血管活性腸肽(VIP)、生長(zhǎng)抑素(SS)、P物質(zhì)(SP)、一氧化氮(NO)等一樣，ANP也是胃腸激素的成員之一，且是一種抑制性遞質(zhì)。

糖尿病患者往往合并胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙，發(fā)生機(jī)制與多種因素有關(guān)，其中胃腸激素失調(diào)是主要原因之一。已經(jīng)有許多研究表明糖尿病患者存在胃動(dòng)素、VIP、SS、SP、NO等多種胃腸激素分泌的失調(diào)〔5～7〕。

研究顯示1型、2型糖尿病患者和大鼠的血漿ANP濃度均明顯升高〔8～10〕，本研究結(jié)果也證明了2型糖尿病大鼠血漿ANP濃度較對(duì)照組和單純肥胖組均升高。然而對(duì)血漿ANP濃度升高的原因尚有不同看法。Allen等〔11〕認(rèn)為血漿ANP的升高可能與血糖升高后導(dǎo)致的血容量增加有關(guān)。但ANP濃度的增加是否與血糖有直接關(guān)系尚不得而知，通過(guò)分析后我們未發(fā)現(xiàn)血漿ANP濃度與血糖存在一定的相關(guān)性。

在胃黏膜中當(dāng)ANP與相應(yīng)受體結(jié)合后使細(xì)胞內(nèi)的cGMP水平增加。通過(guò)cGMP途徑，刺激SS分泌，進(jìn)而抑制胃竇部胃泌素和胃底部組織胺的分泌〔1，2〕，而SS、胃泌素的變化均可抑制胃排空。Guo等〔12〕利用放射自顯影技術(shù)證實(shí)ANP受體還廣泛存在于大鼠胃平滑肌層中，其中以胃竇部密度為最大。他們還進(jìn)一步證實(shí)了ANP可明顯抑制大鼠胃竇環(huán)行肌條的收縮。

本研究結(jié)果說(shuō)明糖尿病大鼠存在液體胃排空延遲和腸通過(guò)時(shí)間延長(zhǎng)，血漿ANP濃度及胃竇平滑肌ANP的表達(dá)增加可能是導(dǎo)致糖尿病大鼠胃腸道排空延遲的原因之一。

1 Gower WR Jr，Dietz JR，Mc Cuen RW，et al.Regulation of atrial natriuretic peptide secretion by cholinergic and PACAP neurons of the gastric antrum〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003;284(1):68-74.

2 Gower WR Jr，Premaratne S，McCuen RW.Gastric atrial natriuretic peptide regulates endocrine secretion in antrum and fundus of human and rat stomach〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003;284(4):638-45.

3 李春輝，郭慧淑，樸蓮花，等.胃腸道中心房利尿鈉肽的研究現(xiàn)狀〔J〕.世界華人消化雜志，2005;13(15):1860-3.

4 劉世雄，嚴(yán) 祥，周 蕓，等.急性心肌梗死大鼠血漿心房鈉尿肽與胃排空的關(guān)系〔J〕.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008;34(2):30-3.

5 Kawagishi T，Nishizawa Y，Okuno Y，et al.Effect of cisapride on gastric emptying of indigestible solids and plasma motilin concentration in diabetic autonomic neuropathy〔J〕.Am J Gastroenterol，1993;88(6):933-8.

6 陳興國(guó)，郭繼強(qiáng)，陳新軍，等.糖尿病胃輕癱患者血清胃泌素升高〔J〕. 臨床檢驗(yàn)雜志，2005;23(5):372.

7 吳 波，鄭長(zhǎng)青，林連捷，等.糖尿病性胃腸病變患者血漿P物質(zhì)和胃動(dòng)素的水平及意義〔J〕.世界華人消化雜志，2003;11(3):367-8.

8 McKenna K，Smith D，Tormey W，et al.Acute hyperglycaemia causes elevation in plasma atrial natriuretic peptide concentrations in type 1 diabetes mellitus〔J〕.Diabet Med，2000;17(2):512-7.

9 Clart BA，Sclater A，Epstein FH，et al.Effect of glucose，insulin and hypertonicity on atrial natriuretic peptide levels in man〔J〕.Metabolism，1993;42(5):224-8.

10 Tanabe A，Naruse M，Wasada T，et al.Effects of acute hyperinsulinaemia on plasma atrial and brain natriuretic peptide concentrations〔J〕.Eur J Endocrinol，1995;132(6):693-8.

11 Allen TJ，Cooper ME，O'Brien RC，et al.Glomerular filtration rate in streptozotocin-induced diabetic rats.Role of exchangeable sodium，vasoactive hormones，and insulin therapy〔J〕.Diabetes，1990;39(10):1182-90.

12 Guo HS，Cui X，Cui YG，et al.Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2003;24(10):1021-6.