李松林 朱妍妍 李 霏 尹元琴 (中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所，遼寧 沈陽 110001)

白細胞介素(IL)-32首先由Kim等〔1〕于2005年利用基因芯片技術研究IL-18誘導高表達基因時發(fā)現(xiàn)的一種高表達細胞因子樣基因，編碼炎癥性細胞因子，命名為白細胞介素32(IL32)。IL32存在 6種剪接變體，Choi等〔2〕研究發(fā)現(xiàn) IL-32γ是IL-32活性最強的剪接變體。近來，Oh等〔3〕進一步研究證實IL-32γ能夠通過滅活NF-κB和STAT3信號蛋白抑制腫瘤細胞的增殖。為深入探討IL-32γ在腫瘤細胞增殖分化過程中的可能作用，我們利用腺病毒具有較高的感染效率、腺病毒載體不整合到染色體中、攜帶的外源基因表達水平高等優(yōu)點，構(gòu)建了人IL-32γ基因的重組腺病毒表達載體，并對重組腺病毒載體Ad-IL-32γ的感染效率和表達進行觀察和檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 DH5α化學感受態(tài)菌株，真核表達質(zhì)粒pDONR223，pAdxsi腺病毒質(zhì)粒及pShuttle-CMV(-)重組穿梭載體由本實驗室提供。

1.2 主要試劑 Platinum Pfx DNA Polymerase試劑盒購自invitrogen公司;引物合成于大連寶生物公司;所用限制性內(nèi)切酶均購自New England Biolabs公司;質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒 (柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)均購自威格拉斯生物技術(北京)有限公司;真核轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000為GIBCO BRL產(chǎn)品;1 kb DNA ladder購自鼎國生物公司。鼠抗人IL-32γ抗體購自Biolegend公司;鼠抗人β-actin抗體購自Santa Cruz公司;羊抗鼠二抗購自中杉公司。

1.3 方法

1.3.1 IL-32γ基因片段的克隆 參照IL-32γ序列設計引物IL-32γ-KpnI-前向:CGGGGTACCACCATGTGCTTCCCGAAG，IL-32γ-EcoRI-反向:CCGGAATTCTCATTTTGAGGATTG。以 pOTB7/IL-32γ為模板，采用Platinum Pfx DNA Polymerase高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，獲得 IL-32γ基因片段。

1.3.2 重組穿梭載體pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ的構(gòu)建及鑒定

1.3.2.1 pShuttle-GFP-CMV重組穿梭載體的KpnI/EcoRI酶切 pShuttle-GFP-CMV 10 μl，10 × Buffer 5 μl，10 × BSA 5 μl，KpnI 15 U，EcoRI 1.5 U，ddH2O 35 μl，總體積 50 μl，37 ℃水浴3.5 h。CIP 0.5 μl，37℃水浴0.5 h。酶切完成后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收5.1 kb片段。

1.3.2.2 KpnI，EcoRI酶切 IL-32γ 片段 IL-32γ 30 μl，10 ×Buffer 5 μl，10 × BSA 5 μl，KpnI 1.5 μl，EcoRI 1.5 μl，ddH2O 7 μl，總體積 50 μl，37 ℃水浴 3.5 h。酶切完成后進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收0.75 kb片段。

1.3.2.3 載體片段與IL-32γ 片段的連接 IL-32γ 6 μl，pShuttle-GFP-CMV 2 μl，10 × ligase Buffer 1 μl，T4 DNA ligase 1 μl，總體積10 μl，22℃水浴3.5 h。取3 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學感受態(tài)細胞DH5α菌株，涂布到卡那抗性固體培養(yǎng)基平皿，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取若干單克隆菌落，接種到卡那抗性液體培養(yǎng)基中，搖床中37℃ 300 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。參照威格拉斯質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒說明書提取質(zhì)粒。KpnI/EcoRI酶切鑒定:pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ 1 μl，10 × Buffer 1 μl，10 × BSA 1 μl，KpnI 1.5 μl，EcoRI 1.5 μl，ddH2O 6.7 μl，總體積 10 μl，37℃水浴1.5 h。陽性克隆將得到0.75 kb條帶。

1.3.3 重組腺病毒載體Ad-IL-32γ的構(gòu)建及鑒定 腺病毒載體pAdxsi的+酶切，I-CeuⅠ10 U，I-SceⅠ 10 U，反應體系同1.3.2.1。乙醇沉淀法回收載體:酶切體系加ddH2O 100 μl，酚75 μl，氯仿 75 μl，充分混勻，12 000 r/min 離心5 min;吸上清至新的離心管中，加入3 mol/L pH5.2的醋酸鈉20 μl，再加入無水乙醇500 μl，－20℃沉淀15 min;4℃離心15 min，小心吸去上清，加入70%乙醇500 μl，4℃離心5 min，小心吸去上清，晾干5 min，加入 ddH2O 100 μl。pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ 的 I-CeuⅠ+I-SceⅠ酶切:操作同1.3.2.2，回收4.4 kb片段。將腺病毒載體片段及IL-32γ目的片段連接并提取后以XhoⅠ酶切鑒定，操作同1.3.2.3。陽性克隆將得到 14.5、11.7、3.4、2.66、2.47、1.45、0.6 kb 條帶。

1.3.4 重組腺病毒載體的擴增、純化及滴度測定 HEK293細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的六孔板中過夜，每孔5×105個細胞。線性化鑒定正確的重組腺病毒載體 Ad-IL-32γ:Ad-IL-32γ 10 μl，10 × Buffer 5 μl，PacⅠ 20 U，ddH2O 39 μl，總體積 50 μl，37 ℃水浴 3.5 h。取線性化的腺病毒載體5 μl稀釋于 300 μl DMEM，室溫放置 5 min，用 Lipofectamine2000脂質(zhì)體按說明書轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后6 h換液。每天觀察細胞出毒跡象。轉(zhuǎn)染后第13天，出現(xiàn)明顯噬斑，細胞大部分脫落，收集細胞及上清，反復凍融3次，3 000 r/min離心5 min，收集上清作為第一代毒種。以后擴增時取2 ml第一代病毒感染一個75 cm細胞培養(yǎng)瓶的細胞，兩天后所有細胞脫落轉(zhuǎn)入15 ml離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml ST buffer(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+2.5%甘油)，混勻，凍融3次后3 000 r/min離心5 min，取上清，作為新的病毒凍存物進行下一輪擴增。采用TCID50方法測定病毒滴度。將293LP細胞接種至96孔板，將病毒上清從10-8稀釋度開始進行8個稀釋梯度的稀釋并轉(zhuǎn)染細胞，每個稀釋度設9個復孔，并設2個陰性對照，轉(zhuǎn)染后第10天進行結(jié)果判定。

1.3.5 感染效率測定 取對數(shù)生長期的HEK293細胞，以2×106個/孔接種于六孔板中，將Ad-IL-32γ分別以MOI(感染復數(shù))50、100、200感染細胞，48 h后于熒光顯微鏡下每孔隨機取5個視野，計數(shù)200個細胞中呈現(xiàn)綠色熒光細胞數(shù)，確定感染百分率。

1.3.6 Western印跡法檢測IL-32γ的表達 取對數(shù)生長期的HEK293細胞，以2×106個/孔接種于六孔板中，分為單純細胞、感染空腺病毒載體細胞和感染重組腺病毒載體細胞3組。感染48 h后收集各組細胞，用預冷的PBS洗細胞3次，每組細胞加入100 μl細胞裂解液(預冷至0℃)以提取總蛋白，蛋白濃度參照BCA試劑盒測定。煮沸變性的蛋白以每孔40 μg的含量加樣，經(jīng)濃縮膠為6%、分離膠為10%的SDS-PAGE電泳分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h。與1∶500鼠抗人IL－32γ抗體4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠IgG(1∶200)山羊抗兔IgG(1∶200)，室溫孵育2 h。洗膜后用化學發(fā)光底物顯影，凝膠成像。

2 結(jié)果

2.1 重組穿梭載體pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ的構(gòu)建及鑒定經(jīng)KpnI/EcoRI酶切鑒定結(jié)果見圖1。重組腺病毒載體Ad-IL-32γ經(jīng)XhoⅠ酶切鑒定結(jié)果，見圖2。

2.2 重組腺病毒載體Ad-IL-32γ的感染效率 以感染復數(shù)分別為50、100、200的重組腺病毒載體 Ad-IL-32γ感染 HEK293細胞48 h后，熒光顯微鏡下隨機取5個視野觀察并計數(shù)每200個293細胞中感染細胞數(shù)目，計算其感染效率分別為(58.66±3.6)%、(95.69±1.7)%和(97.63±2.8)%。

2.3 Western印跡法檢測各組細胞IL-32γ的表達 按單純細胞、感染空腺病毒載體細胞和感染重組腺病毒載體細胞三組感染HEK293細胞48h后，通過Western印跡法檢測HEK293細胞中IL-32γ的表達，可見感染Ad-IL-32γ組細胞表達IL-32γ蛋白，而兩對照組未見表達。見圖3，圖4。

3 討論

隨著細胞生物學、分子生物學研究的深入和DNA重組技術、基因合成技術的飛速發(fā)展，腫瘤的生物治療作為第四種主要治療模式迅速發(fā)展起來。生物治療是指通過各種方式激發(fā)和增強腫瘤患者的免疫功能，其中基因治療是一個主要的生物治療方法。生物免疫治療聯(lián)合傳統(tǒng)的手術、化療、放療可以精準清除殘余腫瘤細胞，防復發(fā)、防轉(zhuǎn)移，提升患者生存質(zhì)量和時間。這給腫瘤的治療提供了新的思路。

IL-32參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。IL-32主要是由NK細胞、T淋巴細胞、內(nèi)皮細胞和血液單核細胞刺激產(chǎn)生的〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)通過在慢性髓細胞性白血病(CML)中過表達IL-32α能夠通過激活p38MAPK途徑使CML細胞的Fas和ULBP2表達增加，而這二者的升高會直接導致NK細胞對CML細胞的敏感性增加，從而達到抗癌的效果〔5，6〕。在轉(zhuǎn)染 IL-32γ的結(jié)腸癌細胞和接種黑素瘤的IL-32γ轉(zhuǎn)基因鼠中過表達IL-32γ能夠通過抑制NF-κB和STAT3途徑使促凋亡蛋白活化的 caspase-3，-9和多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶增加，而抗凋亡蛋白如bcl-2、凋亡蛋白抑制劑(IAP)、XIAP、c-FLIP和細胞增殖標記物(包括細胞周期蛋白D細胞周期蛋白激酶4)水平降低，從而起到抑制腫瘤生長的作用〔7〕。

基因治療研究中，基因轉(zhuǎn)移方法是基因治療的基礎和關鍵。病毒能與細胞表面受體結(jié)合并將其基因組有效導入宿主細胞，因此，可以利用病毒載體進行目的基因轉(zhuǎn)運。腺病毒載體具有宿主細胞范圍廣、高轉(zhuǎn)移效率、高滴度和高表達等優(yōu)點，是目前基因治療研究中應用最為廣泛的載體〔8，9〕。本實驗中將構(gòu)建成的Ad-IL-32γ轉(zhuǎn)染HEK239細胞，并通過實時定量PCR法和Western印跡法證實其能夠在轉(zhuǎn)染后的細胞內(nèi)高效表達，Ad-IL-32γ的成功構(gòu)建為研究IL-32γ基因抑制惡性腫瘤的基因治療奠定基礎。

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2 Choi JD，Bae SY，Hong JW，et al.Identification of the most active interleukin-32 isoform〔J〕.J Immunol，2009;126:535-42.

3 Oh JH，Cho MC，Kim JH，et al.IL-32gamma inhibits cancer cell growth through inactivation of NF-kappaB and STAT3 signals〔J〕.J Oncogene，2011;30(30):3345-59.

4 Kim SH，Han SY，Azam T，et al.Interleukin-32:a cytokine and inducer of TNF alpha〔J〕.J Immunity，2005;22:131-42.

5 Goda C，Kanaji T，Kanaji S，et al.Involvement of IL-32 in activation-induced cell death in T cells〔J〕.J Int Immunol，2006;18(2):233-40.

6 Cheon S，Lee JH，Park S，et al.Overexpression of IL-32alpha increases NK cell-mediated killing through up-regulation of Fas and ULBP2 expression in human chronic myeloid leukemia cells〔J〕.J Biol Chem，2011;286(14):12049-55.

7 Netea MG，Azam T，F(xiàn)erwerda G，et al.IL-32 synergizes with nucleotide oligomerization domain(NOD)1 and NOD2 ligands for IL-1beta and IL-6 production through a caspase 1-dependent mechanism〔J〕.J Proc Natl Acad Sci，2005;102:16309-14.

8 Barzon L，Zanusso M，Colombo F，et al.Clinical trials of gene therapy，virotherapy，and immunotherapy for malignant gliomas〔J〕.J Cancer Gene Ther，2006;13(6):539-54.

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