葛志華 李俊玫 于海忠 楊 寧 楊佳寧 崔宙開(kāi) 王春艷

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研處，河北 承德 067000)

衰老對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程及與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子功能的影響。與衰老有關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)因子及途徑多而復(fù)雜，且與細(xì)胞的類(lèi)型和組織來(lái)源有關(guān)。其中p16/Rb信號(hào)通路、p53/Rb信號(hào)通路起著重要作用。下頜下腺是具有內(nèi)、外雙重分泌功能的腺體，它在內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)機(jī)制中發(fā)揮其獨(dú)特的作用。關(guān)于衰老下頜下腺組織中Rb細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察衰老大鼠下頜下腺組織磷酸化cyclinD1蛋白、p16、非磷酸化Rb蛋白的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 MK3酶標(biāo)儀:芬蘭雷勃公司，PCR儀:美國(guó)MJResearch公司，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:德國(guó)Leica公司。磷酸化cyclinD1抗體:上海邁新生物科技有限公司;p16和非磷酸化Rb單克隆抗體:北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組 實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào):605106，選用8周齡清潔級(jí)SD雌性大鼠30只，體重180～220 g，隨機(jī)分為正常組和模型組，每組15只。

1.3 模型的建立及各組動(dòng)物的處理方法 正常組大鼠正常喂60 d。模型組大鼠腹腔注射6%D-半乳糖(300 mg·kg－1·d－1)，連續(xù) 60 d。

1.4 取材、固定及免疫組織化學(xué)染色 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉后，開(kāi)胸，經(jīng)左心室插管入主動(dòng)脈，生理鹽水沖凈血液后，用4%多聚甲醛進(jìn)行灌注固定、取雙側(cè)下頜下腺，常規(guī)ABC免疫組織化學(xué)染色顯示磷酸化cyclinD1蛋白的表達(dá)。

1.5 Western印跡法檢測(cè)p16INK4a、非磷酸化Rb蛋白含量 提取下頜下腺細(xì)胞總蛋白，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組總蛋白含量，分裝儲(chǔ)存;電泳分離蛋白質(zhì)至溴酚藍(lán)移動(dòng)至膠底部終止。將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;封閉PVDF膜分別加入Rb、p16單克隆抗體(抗體稀釋度:1∶200)，室溫2 h;放入雜交盒，加入HRP標(biāo)記相應(yīng)二抗(抗體稀釋度:1∶2 000)，孵育1 h;將PVDF膜平鋪、顯色、曝光、顯影、定影。將條帶掃描至計(jì)算機(jī)中，用軟件Bandscan5.0進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料描述采用s，組間比較行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 下頜下腺磷酸化cyclinD1蛋白含量的改變 磷酸化cyclinD1蛋白在正常及實(shí)驗(yàn)組大鼠下頜下腺的腺泡細(xì)胞、顆粒曲管及其他導(dǎo)管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，磷酸化cyclinD1陽(yáng)性顆粒散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈黃色或棕黃色，見(jiàn)圖1，模型組磷酸化cyclinD1蛋白的表達(dá)比較正常組明顯降低(P＜0.01)。

圖1 各組下頜下腺cyclinD1蛋白表達(dá)(DAB，×400)

2.2 p16INK4a和非磷酸化Rb蛋白含量檢測(cè)結(jié)果 Rb表達(dá)以模型組明顯高于正常組(P＜0.01);p16表達(dá)模型組比較正常組明顯升高(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠下頜下腺cyclinD1、p16、Rb的表達(dá)( s，n=15)

表1 各組大鼠下頜下腺cyclinD1、p16、Rb的表達(dá)( s，n=15)

與模型組比較:1)P＜0.01

分組 cyclinD1 P16(OD)Rb(OD)正常組 54.78±4.841) 0.48±0.021) 0.81±0.031)模型組19.11±2.21 1.94±0.02 1.69±0.03

3 討論

細(xì)胞衰老是隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞增殖能力和生理功能逐漸下降的變化過(guò)程。細(xì)胞衰老過(guò)程受控于細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)。衰老對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程及與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)p16INK4a-pRb和ARF-p53這兩條細(xì)胞調(diào)控通路與細(xì)胞衰老過(guò)程密切相關(guān)〔1〕，任何一條通路的阻滯，都能讓細(xì)胞的周期出現(xiàn)停滯。

細(xì)胞周期的進(jìn)程受cyclin、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制物(CKI)等調(diào)控因子及相互作用的調(diào)節(jié)。cyclinD1是G1期蛋白，在G1期和G1/S期交界處發(fā)揮作用，與CDK4/CDK6形成復(fù)合體催化Rb蛋白磷酸化。Rb蛋白對(duì)細(xì)胞周期中最關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)G1/S期、G2/M期起著“閘門(mén)”的作用，Rb蛋白磷酸化后失活，釋放核轉(zhuǎn)錄因子E2F，游離的E2F啟動(dòng)G1/S期轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。p16INK4a基因是CDKI基因家族成員，其產(chǎn)物p16INK4a蛋白可以特異性的與CDK4/CDK6結(jié)合，抑制CDK4/CDK6介導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤pRb的磷酸化，非磷酸化的Rb與轉(zhuǎn)錄因子E2Fs結(jié)合，進(jìn)而阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期啟動(dòng)染色體的復(fù)制，使細(xì)胞周期停滯〔2〕。Krishnamurthy 等〔3〕提出 p16INK4a的表達(dá)能夠作為生理上的衰老的一個(gè)標(biāo)志物。有研究表明，在衰老大鼠睪丸組織Rb基因和p16蛋白表達(dá)明顯增高，p-Rb蛋白表達(dá)明顯降低〔4，5〕。劉維潮等〔6〕研究顯示，在衰老大鼠腦組織p16蛋白表達(dá)較正常組明顯增高，p-Rb蛋白表達(dá)較正常組明顯降低。

另有研究〔7〕表明，在衰老的人成纖維細(xì)胞中CDKI因子增多，cyclinD mRNA水平比休眠細(xì)胞高很多倍，這必然導(dǎo)致過(guò)量的cyclinD產(chǎn)生，但多為無(wú)活性的cyclinD/CDK4復(fù)合物，而磷酸化cyclinD卻比休眠細(xì)胞少得多，而只有這種磷酸化的cyclinD才可以提高復(fù)合物的活性。衰老細(xì)胞中雖然CDK2總磷酸化水平不變，但cyclinD、E-CDK中的磷酸化水平卻下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞停滯于G1期。

本研究提示D-半乳糖可能通過(guò)誘導(dǎo)cyclinD蛋白非磷酸化、提高p16蛋白含量以促進(jìn)Rb蛋白磷酸化等多個(gè)環(huán)節(jié)加速了通過(guò)p16/cyclinD/CDK4-CDK6/Rb/E2F途徑對(duì)Rb蛋白的非磷酸化，阻滯細(xì)胞增殖，導(dǎo)致衰老。

綜上，D-半乳糖誘發(fā)的大鼠下頜下腺細(xì)胞衰老與Rb/p16細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的阻滯密切相關(guān)。

1 王 芳，關(guān)云謙.p16ink4a/p14ARF基因在細(xì)胞衰老和腫瘤抑制中的作用研究進(jìn)展〔J〕.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011;32(1):100-5.

2 Lea NC，Orr SJ，Stoeber K，et al.Commitment point during Go-G，that controls entry into the cell cycle〔J〕.Mol Cell Biol，2003;23(7):2351-61.

3 Krishnamurthy J，Torrice C，Ramsey MR，et al.Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging〔J〕.J Clin Invest，2004;114:1299-307.

4 牛嗣云，陳 龍，高福祿，等.P53PRb細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因和蛋白在衰老大鼠睪丸組織的表達(dá)〔J〕.解剖學(xué)報(bào)，2008;39(6):841-4.

5 牛嗣云，龐曉靜，高福祿，等.松花粉對(duì)衰老大鼠睪丸p53/Rb細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(14):1780-2.

6 劉維潮，王 靜，王雙輝，等.何首烏飲對(duì)衰老大鼠腦組織Rb細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響〔J〕.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009;26(4):454-5.

7 Dulic V，Drullinger LF.Altered regulation of G1 cyclin in senescent human diploid fibroblasts〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1993;90:11034.