胡祥上 宮德正 易傳安 鄒 原 (懷化醫(yī)學高等?？茖W?；A醫(yī)學部，湖南 懷化 48000)

衰老又稱老化，是指生物體在其生命的后期所進行的全身性、多方面、循序漸進的退化過程，這種退化過程在整體水平、組織細胞水平及分子水平均有體現(xiàn)〔1〕。實驗研究表明，由于機體免疫功能隨年齡下降，從而導致自身免疫疾病以及癌癥發(fā)生的增多〔2〕。解耦聯(lián)蛋白2(UCP2)屬于線粒體內膜上質子轉運家族中的成員之一，廣泛表達于哺乳動物多種組織，其誘導質子漏的一個重要作用是減少線粒體ROS的產生。UCP2的高表達可預防氧化損傷，而抑制UCP2的表達則可在多種細胞類型中促進氧化損傷〔3〕。本研究擬觀察不同年齡、生理狀態(tài)下大鼠脾、胸腺組織中UCP2表達與ROS含量的關系，探討UCP2在不同生理狀態(tài)下抗脾、胸腺組織氧化損傷與細胞衰老及免疫功能的關系與作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只〔由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，系清潔級動物，實驗動物使用許可證號SYXK(遼)2002～0005〕，按年齡分為幼年組〔年齡21 d，體重(82±5)g〕、成年組〔年齡3個月，體重(181±12)g〕和老年組〔年齡18個月，體重(500±20)g〕，每組10只，不同組別動物分籠喂養(yǎng)，動物自由進食進水，室溫，自然晝夜。實驗室適應性喂養(yǎng)7 d后進行實驗，術前禁食12 h。

1.2 主要試劑 UCP2山羊抗人多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)、HRP標記兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司，美國)、生物素化兔抗山羊IgG(Santa Cruz公司，美國)、正常兔血清(北京中山生物技術有限公司)、濃縮型SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、丙二醛測定試劑盒、谷胱甘肽測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、ATP生物試劑盒(碧云天生物試劑公司)。

1.3 方法 ①脾、胸腺組織中MDA、GSH含量的測定:取脾、胸腺組織各0.5 g，分別加入4.5 ml PBS制成10%勻漿，3 000 r/min離心15 min后取上清。按試劑盒說明書操作，測定丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量。上述操作均在冰上進行，用Bradford法測定蛋白含量。②脾、胸腺指數(shù)測定:術前禁食、禁水12 h，將大鼠斷頭處死，采用無菌方法取脾臟和胸腺，用電子天平稱重，并計算指數(shù)。③免疫組織化學方法檢測大鼠脾、胸腺內UCP2蛋白的表達:分別取脾、胸腺組織大約1 cm×1 cm×1 cm，洗凈血污，除去結締組織。10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片(3～4 μm)，貼片(多聚賴氨酸掛片)后烤干。用SABC法進行免疫組織化學檢測。常規(guī)脫蠟至水;3%過氧化氫甲醇室溫孵育15 min，以消除內源性過氧化物酶反應;0.01 mol/L枸櫞酸熱修復抗原15 min;正常兔血清室溫封閉30 min;羊抗UCP2(1∶150)4℃孵育過夜;生物素化兔抗羊IgG(1∶150)，室溫孵育30 min;SABC 試劑(1∶100)室溫孵育30 min;新鮮配制0.05%DAB(含0.01%H2O2)顯色，適時用PBS終止反應。以上各步驟間均用PBS-T(0.01mol/L PBS，0.05%Tween-20，pH7.4)清洗切片5 min×4次。乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、光鏡下檢查并攝片。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件，實驗數(shù)據(jù)以s表示，用t檢驗進行統(tǒng)計分析，組間差異的比較采用方差分析。

2 結果

2.1 不同年齡大鼠脾、胸腺組織內MDA含量的變化 MDA測定結果顯示，老年組大鼠脾、胸腺組織中MDA含量〔(14.21±0.81)、(4.22 ±0.26)nmol/mg〕明顯高于幼年組〔(13.18 ±2.38)、(2.35±1.05)nmol/mg〕和成年組〔(27.16±0.47)、(16.19 ±2.42)nmol/mg，P ＜0.01〕。

2.2 不同年齡大鼠脾、胸腺組織GSH含量的變化 不同年齡大鼠脾、胸腺組織GSH測定結果顯示，GSH在老年大鼠脾組織中含量較成年大鼠及幼年大鼠顯著下降〔(177.09±39.22)vs(285.36±5.01)、(378.85 ±43.23)mg/g，P ＜0.01〕，在老年大鼠胸腺組織中含量較幼年大鼠顯著下降〔(114.61±1.75)vs(225.30±4.54)mg/g，P ＜0.01〕與成年大鼠無差異〔(120.36±14.93)mg/g，P ＞0.05〕。

2.3 不同年齡大鼠脾、胸腺指數(shù)的變化 不同年齡大鼠脾、胸腺指數(shù)測定結果顯示，老年大鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均下降〔(16.19±3.42)、(0.85±0.02)mg/g〕。老年大鼠胸腺指數(shù)明顯低于幼年組和成年組〔(2.35±1.05)、(0.32±0.04)mg/g，(4.22 ±0.26)、(0.24±0.06)mg/g，P ＜0.01〕。

2.4 不同年齡大鼠脾、胸腺實質細胞UCP2表達的變化 幼年組、成年組大鼠脾、胸腺實質細胞內UCP2表達較少(幾乎無表達)，而老年組大鼠脾、胸腺實質細胞內UCP2表達較多。見圖1。

圖1 不同年齡組大鼠脾、胸腺細胞UCP2表達的免疫組織化學觀察(DAB，×400)

3 討論

MDA、GSH含量的變化 MDA、GSH含量的多少，均可以反映胸腺內活性氧(ROS)水平〔4，5〕。體內ROS的來源可分為內源性和外源性兩方面，其中線粒體膜可產生各種各樣的ROS。ROS除了通過氧化損傷對細胞造成直接損傷外，還能啟動一系列的衰老信號傳導途徑，促進細胞衰老〔6〕。本實驗結果表明老年大鼠脾、胸腺組織的抗氧化損傷能力降低。

隨年齡的增長，機體的免疫功能發(fā)生紊亂并逐步衰退。有實驗證實〔7〕，衰老使老年人及實驗動物的免疫功能下降。衰老大鼠脾淋巴細胞的增殖能力及巨噬細胞的吞噬功能均明顯下降〔8〕。IL-2和IL-6是反映機體免疫功能強弱的重要指標，IL-2主要由活化的T細胞產生，IL-6主要由單核巨噬細胞、T細胞、B細胞等產生的細胞因子。IL-2產生減少和IL-6水平異常升高均加速機體的衰老進程〔9，10〕。目前研究認為〔11〕，UCP2 可通過控制細胞ROS水平，反映在巨噬細胞介導的免疫起重要作用。本研究結果，在生理狀態(tài)下隨大鼠年齡的增長，脾、胸腺組織內ROS含量增多，ROS含量增多對 UCP2的表達有激活作用，UCP2的激活又反饋降低細胞內ROS的含量，從而延緩機體衰老，增強機體免疫功能。

研究顯示〔12，13〕，在許多細胞內存在 UCP2-ROS 抗氧化系統(tǒng)，UCP2通過降低ROS產生，保護細胞免受ROS誘導的細胞凋亡。隨動物年齡增加，體內ROS含量增多，ROS含量對UCP2表達有激活作用〔14〕;UCP2的激活又可以降低細胞內ROS的含量〔15〕。本結果發(fā)現(xiàn)老年組大鼠脾、胸腺實質細胞內UCP2表達較多，幼年組和成年組大鼠脾、胸腺實質細胞內UCP2表達較少(甚至無表達)。老年組大鼠脾、胸腺組織ROS增多，引發(fā)UCP2的表達增多;UCP2又可以降低ROS對細胞氧化損傷能力，從而對延緩機體由于細胞氧化損傷而引起的衰老有著積極意義。

目前，UCP2調節(jié)ROS的機制尚未完全明了，因此，UCP2與ROS、ROS與衰老之間調節(jié)及UCP2對免疫功能影響的作用機制有待進一步研究。

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