梅志剛 劉曉潔 曾永保 肖長義 黎家華 胡 衛(wèi) 陳良金

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級實驗室，湖北 宜昌 443002)

糖尿病患者體內(nèi)高脂、高糖、高胰島素血癥及其他精神因素慢性刺激而引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程，包括氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、非酶性糖基化終末產(chǎn)物的形成、蛋白激酶C信號通路和多元醇通路激活以及己糖胺通路活性升高等〔1〕，臨床研究發(fā)現(xiàn)，電針耳甲區(qū)迷走神經(jīng)分布區(qū)穴位具有即時降低血糖，改善糖耐量等作用〔2，3〕;本課題組前期實驗研究還發(fā)現(xiàn)耳針具有抗炎，減低胰島素抵抗等作用〔4〕。本研究試圖揭示耳針防治糖尿病血管并發(fā)癥的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SD大鼠80只，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心〔動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2010-0007〕，體重200～220 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)數(shù)字表法挑選10只作為正常組大鼠(組1)，以普通飼料喂養(yǎng)。其余70只采用高脂、高糖飼料(蛋白質(zhì)23%，碳水化合物53%，脂肪5%，纖維19%)飼養(yǎng)8 w后禁食12 h，按35 mg/kg劑量1次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)，參照Srinivasan等方法建立2型糖尿病大鼠模型。注射STZ 1 w后尾靜脈取血約0.05 ml以O(shè)netouch血糖儀(強(qiáng)生公司)測定空腹血糖(FBG)，并以FBG≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠模型。將造模成功的49只大鼠(另外21只大鼠因造模失敗或死亡而排除)隨機(jī)分為:模型組(組2，共6只)、耳針組(組3，共8只)、迷走神經(jīng)切斷組(組4，共7只)、阿托品組(組 5，共8只)、六烴季銨組(組 6，共 7只)和α-銀環(huán)蛇毒素組(組7，共7只)。各組分別作如下處理:組2動物未作處理，為模型對照;組3:電針刺激大鼠耳胰膽及神門穴，每次30 min(根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果刺激強(qiáng)度為2 mA，頻率10 Hz，脈寬0.4 ms)。組4～7均在給予組3同樣的耳穴電針刺激之前作如下處理:組4動物切斷耳針刺激側(cè)頸部迷走神經(jīng);組5、組6和組7分別給予尾靜脈注射阿托品(0.1 mg/kg)、六烴季銨(10 mg/kg)和α-銀環(huán)蛇毒素(1.0 μg/kg)，上述各組處理1次/d，共計10 d。最后一次處理結(jié)束，立即以20%烏拉坦200 g/ml麻醉大鼠，腹主動脈采血，離心收集大鼠血清，以0.22 μm濾膜過濾除菌，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(BMEC)購自上海拜力生物科技有限公司(批號:11875-093)，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原蛋白呈陽性表達(dá)。正常細(xì)胞培養(yǎng)液每100 ml各成分含量為:1640培養(yǎng)液87 ml、胎牛血清10 ml、丙酮酸鈉 1 ml、HEPES液 1 ml、1 U 的雙抗1 ml。待細(xì)胞鋪滿瓶底時，以0.125%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸鈉(EDTA)消化，傳代，鏡下調(diào)整細(xì)胞密度為8×103/cm2，傳代后每3 d換液1次，傳代細(xì)胞4～6 d可形成鋪路石樣緊密分布，傳至第4代的細(xì)胞用于實驗。

1.3 糖尿病血管并發(fā)癥細(xì)胞模型制作及分組處理 將上述正常培養(yǎng)細(xì)胞分為7組(每組12孔):正常對照組、模型對照組、針刺組、迷走神經(jīng)切斷組、阿托品組、六烴季銨組、α-銀環(huán)蛇毒素組。正常對照組以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余6組根據(jù)筆者以往研究結(jié)果〔5〕，分別加入糖尿病血管并發(fā)癥內(nèi)皮細(xì)胞模型造模條件培養(yǎng)液:含有 20 mmol/L葡萄糖、100 mU/L胰島素和200 mg/L氧化型低密度脂蛋白的無血清培養(yǎng)基(下簡稱造模液)，同時分別加入上述實驗動物收集的組2～7的耳針血清，并配置成10%的終濃度，即A正常組條件培養(yǎng)液為:1640培養(yǎng)基;B模型組:造模液+10%組2大鼠血清;C針刺組:造模液+10%組3大鼠血清;D迷走神經(jīng)切斷組:造模液+10%組4大鼠血清;E阿托品組:造模液+10%組5大鼠血清;F六烴季胺組:造模液+10%組6大鼠血清;G α-銀環(huán)蛇毒素組:造模液 +10%組7大鼠血清。各組細(xì)胞加入上述條件培養(yǎng)液后于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察各組細(xì)胞活性及形態(tài)學(xué)變化。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 MTS/PMS比色分析法測定各組細(xì)胞的活性 將正常培養(yǎng)的細(xì)胞消化后離心重懸，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為(3～5)×104/ml后接種于96孔板中，為防止孔板導(dǎo)致的邊緣效應(yīng)，共接種細(xì)胞48孔，每孔100 μl，將接種的細(xì)胞分為7組:正常對照組、模型對照組、耳針組、迷走神經(jīng)切斷組、阿托品組、六烴季銨組、α-銀環(huán)蛇毒素組，每組6孔。接種后24 h待細(xì)胞貼壁正常生長后，小心吸走培養(yǎng)基，各組分別加入1.2中所述的條件培養(yǎng)液100 μl，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加50 μl 1×MTT溶液，37℃孵育4 h→吸出上清液→每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)→平板搖床搖勻→酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測每孔的吸光度值(OD值)。

1.4.2 流式細(xì)胞儀觀察內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況 細(xì)胞凋亡檢測按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行:將細(xì)胞條件培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌細(xì)胞1次，以胰酶(不含有EDTA)將各組細(xì)胞消化下來，加入上述收集的細(xì)胞條件培養(yǎng)液，稍混勻，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，并計數(shù)。取1.5×105個/ml重懸的細(xì)胞，離心 5 min，棄上清，加入 500 μl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞后，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入5 μl碘化丙啶，室溫(20℃ ～25℃)避光孵育10 min后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.4.3 透射電鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 以0.25%胰酶-0.02%EDTA聯(lián)合消化液將各組細(xì)胞消化下來，離心后PBS洗滌3次，去除殘留的EDTA，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/ml，輕輕反復(fù)吹打均勻，800 r/min離心5 min后，以2.5%戊二醛前固定約2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次(10 min/次)，1%鋨酸后固定1 h，0.1 mol/L PBS漂洗 3次(10 min/次)，丙酮逐級脫水(50%、70%、90%、100%)，丙酮與EPON812環(huán)氧樹脂包埋劑1∶1比例浸泡→純包埋劑浸泡→包埋→修塊機(jī)修塊定位→超薄切片機(jī)切片→醋酸鈾與硝酸鉛雙重染色，最后日立H-7500透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性MTS/PMS比色分析法測定結(jié)果 正常組細(xì)胞活性正常，良好生長(0.608±0.045);與正常組相比較，模型組細(xì)胞活性明顯下降(0.324±0.051，P＜0.01);給予阿托品組、耳針組含藥血清后，細(xì)胞活性較模型組細(xì)胞活性有明顯改善(0.506±0.037，0.515±0.029，P＜0.01);但迷走神經(jīng)切斷組、六烴季銨組以及α-銀環(huán)蛇毒素組大鼠血清后，其細(xì)胞活性仍明顯低于正常組和耳針組(0.330±0.047、0.362±0.130、0.355±0.038，均P＜0.01)，且與模型組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡或壞死情況 正常組細(xì)胞良好生長，細(xì)胞凋亡率較低，主要分布于左下象限;模型組細(xì)胞凋亡較多，分布于右上象限(Q2)和右下象限(Q4)細(xì)胞比例較正常組明顯升高，差異顯著(P＜0.01);而耳針組，阿托品組細(xì)胞凋亡率較模型組細(xì)胞顯著減少(均P＜0.01);給予迷走神經(jīng)切斷組、六烴季銨組和α-銀環(huán)蛇毒素組動物血清后，細(xì)胞凋亡率仍顯著高于正常組和耳針組(均P＜0.05)，但與模型組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率(%，s)

表1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率(%，s)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與耳針組比較:5)P＜0.05，6)P＜0.01

10 9.28±0.84 5.30±0.65 85.33±1.33模型組 6 31.80±1.772) 37.88±3.372) 30.15±4.682)耳針組 8 22.33±1.662)4)29.90±3.022)4)47.63±4.282)4)阿托品組 8 22.55±1.032)4)32.13±4.132)4)47.08±3.682)4)迷走神經(jīng)切斷組 7 31.63±1.312)6)35.63±1.762)4)6)32.53±3.212)6)六烴季銨組 7 30.28±1.822)6)34.13±3.242)6)33.25±5.282)6)α-銀環(huán)蛇毒素組 8 30.30±0.832)6)34.78±2.282)6)32.88±1.462)6)早期凋亡率 晚期凋亡率 存活率正常組組別 n

2.3 透射電鏡觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 正常組(A)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰可見;模型組(B)接受造模條件培養(yǎng)液孵化培養(yǎng)后，損傷明顯，可見細(xì)胞凋亡的標(biāo)志凋亡小體;給予耳針組(C)或阿托品組(D)血清后，內(nèi)皮細(xì)胞受高脂高糖損傷明顯減小，耳針組可見到清晰的細(xì)胞微絨毛，說明細(xì)胞新陳代謝較為旺盛，生存狀態(tài)較模型組有明顯改善;而阿托品組細(xì)胞僅見到染色質(zhì)加深而未見凋亡小體，說明細(xì)胞狀態(tài)也較模型組良好;給予迷走神經(jīng)切斷組(E)血清后，細(xì)胞受損情況較模型組沒有明顯改善，細(xì)胞膜碎裂，核內(nèi)物質(zhì)向細(xì)胞外散失，已具凋亡細(xì)胞的特征;而給予六烴季銨組(F)血清后，細(xì)胞凋亡情況也較為明顯，細(xì)胞核已碎裂為2部分，凋亡小體也可清晰可見，其細(xì)胞狀態(tài)較模型組沒有明顯改善;α-銀環(huán)蛇毒素組(G)細(xì)胞狀態(tài)也較差，與模型組細(xì)胞類似，可見到明顯的凋亡小體。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為耳與經(jīng)絡(luò)以及臟腑功能有著密切的聯(lián)系，《靈樞·邪氣臟腑病形篇》云:“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其氣血皆上于面而走空竅，其精陽氣上走于目而為睛，其別氣走于耳而為聽。”晚清醫(yī)家張振鋆與其族弟張地山著有《厘正按摩要術(shù)》-書中則提出了耳背分屬五臟的理論，指出“耳珠屬腎，耳輪屬脾，耳上輪屬心，耳皮肉屬肺，耳背玉樓屬肝”等耳與五臟分屬的生理聯(lián)系。因此，正如《衛(wèi)生寶鑒》指出的那樣:“五臟六腑，十二經(jīng)脈皆有絡(luò)于耳者。”

本課題組以往研究顯示，耳甲腔穴位胰膽電針刺激能影響孤束核葡萄糖敏感神經(jīng)元以及胰島素敏感神經(jīng)元的自發(fā)性放電頻率〔6〕;進(jìn)一步采用逆行神經(jīng)示蹤法研究發(fā)現(xiàn)，耳甲腔迷走神經(jīng)耳支末梢與孤束核以及迷走神經(jīng)背核具有投射關(guān)聯(lián)〔7〕，據(jù)此推測耳針作用機(jī)制可能與興奮迷走神經(jīng)有關(guān)。Tracy等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)刺激或采用膽堿能激動劑可促使神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿并作用于炎性細(xì)胞表面的乙酰膽堿的N型受體α7亞單位(α7nAChR)，抑制炎癥因子，如 IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α等及趨化因子合成和釋放，從而降低或阻止局部或全身的炎癥反應(yīng)，這一機(jī)制被命名為“膽堿能抗炎通路”。前期研究顯示，電針耳甲區(qū)穴位(有迷走神經(jīng)耳支分布)可降低2型糖尿病模型大鼠循環(huán)血液中促炎因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α以及C-反應(yīng)蛋白(CRP)的水平，并改善胰島素抵抗指數(shù)，據(jù)此推測耳針刺激可能具有與迷走神經(jīng)刺激相類似的膽堿能抗炎效應(yīng)〔4〕。

本研究結(jié)果提示耳針血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)膽堿能M受體阻斷劑阿托品對耳針保護(hù)作用無影響，而N型AchR阻斷劑六烴季銨組和N型AchR α7亞單位拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素則則能夠阻斷耳針血清的保護(hù)效應(yīng)。據(jù)此推測耳針效應(yīng)可能是通過興奮迷走神經(jīng)，并促進(jìn)乙酰膽堿的釋放及與其AchR α7亞單位結(jié)合而介導(dǎo)的。這一結(jié)果與李建國等〔9〕針刺足三里激活膽堿能抗炎通路抗大鼠失血性休克的研究結(jié)果類似。

本文所采用的“針刺血清”的方法是受“血清藥理學(xué)”和“中藥血清學(xué)”的啟發(fā)而提出的，該方法與以往在體實驗檢測針灸后的人或動物血清成分含量及其變化相比，可排除體內(nèi)多因素的影響，獲得了較為理想的結(jié)果，克服了在體實驗的局限性〔10〕。然而，對于針刺血清來源、血清有效部位及其作用對象和作用途徑等，學(xué)界尚未達(dá)成一致的共識，因此關(guān)于針刺血清實驗方法尚待進(jìn)一步規(guī)范與改進(jìn)。

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