梅志剛 劉曉潔 曾永保 肖長義 黎家華 胡 衛(wèi) 陳良金

(三峽大學醫(yī)學院 國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級實驗室，湖北 宜昌 443002)

糖尿病患者體內高脂、高糖、高胰島素血癥及其他精神因素慢性刺激而引發(fā)的內皮細胞損傷過程，包括氧化應激、炎性反應、非酶性糖基化終末產物的形成、蛋白激酶C信號通路和多元醇通路激活以及己糖胺通路活性升高等〔1〕，臨床研究發(fā)現(xiàn)，電針耳甲區(qū)迷走神經分布區(qū)穴位具有即時降低血糖，改善糖耐量等作用〔2，3〕;本課題組前期實驗研究還發(fā)現(xiàn)耳針具有抗炎，減低胰島素抵抗等作用〔4〕。本研究試圖揭示耳針防治糖尿病血管并發(fā)癥的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SD大鼠80只，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心〔動物生產許可證號:SCXK(鄂)2010-0007〕，體重200～220 g，適應性飼養(yǎng)1 w后，隨機數(shù)字表法挑選10只作為正常組大鼠(組1)，以普通飼料喂養(yǎng)。其余70只采用高脂、高糖飼料(蛋白質23%，碳水化合物53%，脂肪5%，纖維19%)飼養(yǎng)8 w后禁食12 h，按35 mg/kg劑量1次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)，參照Srinivasan等方法建立2型糖尿病大鼠模型。注射STZ 1 w后尾靜脈取血約0.05 ml以Onetouch血糖儀(強生公司)測定空腹血糖(FBG)，并以FBG≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠模型。將造模成功的49只大鼠(另外21只大鼠因造模失敗或死亡而排除)隨機分為:模型組(組2，共6只)、耳針組(組3，共8只)、迷走神經切斷組(組4，共7只)、阿托品組(組 5，共8只)、六烴季銨組(組 6，共 7只)和α-銀環(huán)蛇毒素組(組7，共7只)。各組分別作如下處理:組2動物未作處理，為模型對照;組3:電針刺激大鼠耳胰膽及神門穴，每次30 min(根據(jù)預實驗結果刺激強度為2 mA，頻率10 Hz，脈寬0.4 ms)。組4～7均在給予組3同樣的耳穴電針刺激之前作如下處理:組4動物切斷耳針刺激側頸部迷走神經;組5、組6和組7分別給予尾靜脈注射阿托品(0.1 mg/kg)、六烴季銨(10 mg/kg)和α-銀環(huán)蛇毒素(1.0 μg/kg)，上述各組處理1次/d，共計10 d。最后一次處理結束，立即以20%烏拉坦200 g/ml麻醉大鼠，腹主動脈采血，離心收集大鼠血清，以0.22 μm濾膜過濾除菌，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大鼠腦微血管內皮細胞培養(yǎng) 大鼠腦微血管內皮細胞株(BMEC)購自上海拜力生物科技有限公司(批號:11875-093)，經免疫熒光細胞化學法檢測Ⅷ因子相關抗原蛋白呈陽性表達。正常細胞培養(yǎng)液每100 ml各成分含量為:1640培養(yǎng)液87 ml、胎牛血清10 ml、丙酮酸鈉 1 ml、HEPES液 1 ml、1 U 的雙抗1 ml。待細胞鋪滿瓶底時，以0.125%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸鈉(EDTA)消化，傳代，鏡下調整細胞密度為8×103/cm2，傳代后每3 d換液1次，傳代細胞4～6 d可形成鋪路石樣緊密分布，傳至第4代的細胞用于實驗。

1.3 糖尿病血管并發(fā)癥細胞模型制作及分組處理 將上述正常培養(yǎng)細胞分為7組(每組12孔):正常對照組、模型對照組、針刺組、迷走神經切斷組、阿托品組、六烴季銨組、α-銀環(huán)蛇毒素組。正常對照組以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余6組根據(jù)筆者以往研究結果〔5〕，分別加入糖尿病血管并發(fā)癥內皮細胞模型造模條件培養(yǎng)液:含有 20 mmol/L葡萄糖、100 mU/L胰島素和200 mg/L氧化型低密度脂蛋白的無血清培養(yǎng)基(下簡稱造模液)，同時分別加入上述實驗動物收集的組2～7的耳針血清，并配置成10%的終濃度，即A正常組條件培養(yǎng)液為:1640培養(yǎng)基;B模型組:造模液+10%組2大鼠血清;C針刺組:造模液+10%組3大鼠血清;D迷走神經切斷組:造模液+10%組4大鼠血清;E阿托品組:造模液+10%組5大鼠血清;F六烴季胺組:造模液+10%組6大鼠血清;G α-銀環(huán)蛇毒素組:造模液 +10%組7大鼠血清。各組細胞加入上述條件培養(yǎng)液后于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察各組細胞活性及形態(tài)學變化。

1.4 指標檢測

1.4.1 MTS/PMS比色分析法測定各組細胞的活性 將正常培養(yǎng)的細胞消化后離心重懸，細胞計數(shù)板計數(shù)，調整細胞密度為(3～5)×104/ml后接種于96孔板中，為防止孔板導致的邊緣效應，共接種細胞48孔，每孔100 μl，將接種的細胞分為7組:正常對照組、模型對照組、耳針組、迷走神經切斷組、阿托品組、六烴季銨組、α-銀環(huán)蛇毒素組，每組6孔。接種后24 h待細胞貼壁正常生長后，小心吸走培養(yǎng)基，各組分別加入1.2中所述的條件培養(yǎng)液100 μl，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加50 μl 1×MTT溶液，37℃孵育4 h→吸出上清液→每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)→平板搖床搖勻→酶標儀在570 nm波長處檢測每孔的吸光度值(OD值)。

1.4.2 流式細胞儀觀察內皮細胞的凋亡情況 細胞凋亡檢測按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行:將細胞條件培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌細胞1次，以胰酶(不含有EDTA)將各組細胞消化下來，加入上述收集的細胞條件培養(yǎng)液，稍混勻，離心5 min，棄上清，收集細胞，并計數(shù)。取1.5×105個/ml重懸的細胞，離心 5 min，棄上清，加入 500 μl結合液輕輕重懸細胞后，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入5 μl碘化丙啶，室溫(20℃ ～25℃)避光孵育10 min后，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.4.3 透射電鏡觀察各組細胞的超微結構變化 以0.25%胰酶-0.02%EDTA聯(lián)合消化液將各組細胞消化下來，離心后PBS洗滌3次，去除殘留的EDTA，調整細胞密度至1×106個/ml，輕輕反復吹打均勻，800 r/min離心5 min后，以2.5%戊二醛前固定約2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次(10 min/次)，1%鋨酸后固定1 h，0.1 mol/L PBS漂洗 3次(10 min/次)，丙酮逐級脫水(50%、70%、90%、100%)，丙酮與EPON812環(huán)氧樹脂包埋劑1∶1比例浸泡→純包埋劑浸泡→包埋→修塊機修塊定位→超薄切片機切片→醋酸鈾與硝酸鉛雙重染色，最后日立H-7500透射電鏡觀察各組細胞超微結構變化。

2 結果

2.1 各組細胞活性MTS/PMS比色分析法測定結果 正常組細胞活性正常，良好生長(0.608±0.045);與正常組相比較，模型組細胞活性明顯下降(0.324±0.051，P＜0.01);給予阿托品組、耳針組含藥血清后，細胞活性較模型組細胞活性有明顯改善(0.506±0.037，0.515±0.029，P＜0.01);但迷走神經切斷組、六烴季銨組以及α-銀環(huán)蛇毒素組大鼠血清后，其細胞活性仍明顯低于正常組和耳針組(0.330±0.047、0.362±0.130、0.355±0.038，均P＜0.01)，且與模型組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡或壞死情況 正常組細胞良好生長，細胞凋亡率較低，主要分布于左下象限;模型組細胞凋亡較多，分布于右上象限(Q2)和右下象限(Q4)細胞比例較正常組明顯升高，差異顯著(P＜0.01);而耳針組，阿托品組細胞凋亡率較模型組細胞顯著減少(均P＜0.01);給予迷走神經切斷組、六烴季銨組和α-銀環(huán)蛇毒素組動物血清后，細胞凋亡率仍顯著高于正常組和耳針組(均P＜0.05)，但與模型組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率(%，s)

表1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率(%，s)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與耳針組比較:5)P＜0.05，6)P＜0.01

10 9.28±0.84 5.30±0.65 85.33±1.33模型組 6 31.80±1.772) 37.88±3.372) 30.15±4.682)耳針組 8 22.33±1.662)4)29.90±3.022)4)47.63±4.282)4)阿托品組 8 22.55±1.032)4)32.13±4.132)4)47.08±3.682)4)迷走神經切斷組 7 31.63±1.312)6)35.63±1.762)4)6)32.53±3.212)6)六烴季銨組 7 30.28±1.822)6)34.13±3.242)6)33.25±5.282)6)α-銀環(huán)蛇毒素組 8 30.30±0.832)6)34.78±2.282)6)32.88±1.462)6)早期凋亡率 晚期凋亡率 存活率正常組組別 n

2.3 透射電鏡觀察各組內皮細胞的超微結構變化 正常組(A)內皮細胞結構正常，核仁清晰可見;模型組(B)接受造模條件培養(yǎng)液孵化培養(yǎng)后，損傷明顯，可見細胞凋亡的標志凋亡小體;給予耳針組(C)或阿托品組(D)血清后，內皮細胞受高脂高糖損傷明顯減小，耳針組可見到清晰的細胞微絨毛，說明細胞新陳代謝較為旺盛，生存狀態(tài)較模型組有明顯改善;而阿托品組細胞僅見到染色質加深而未見凋亡小體，說明細胞狀態(tài)也較模型組良好;給予迷走神經切斷組(E)血清后，細胞受損情況較模型組沒有明顯改善，細胞膜碎裂，核內物質向細胞外散失，已具凋亡細胞的特征;而給予六烴季銨組(F)血清后，細胞凋亡情況也較為明顯，細胞核已碎裂為2部分，凋亡小體也可清晰可見，其細胞狀態(tài)較模型組沒有明顯改善;α-銀環(huán)蛇毒素組(G)細胞狀態(tài)也較差，與模型組細胞類似，可見到明顯的凋亡小體。

3 討論

中醫(yī)學認為耳與經絡以及臟腑功能有著密切的聯(lián)系，《靈樞·邪氣臟腑病形篇》云:“十二經脈，三百六十五絡，其氣血皆上于面而走空竅，其精陽氣上走于目而為睛，其別氣走于耳而為聽?！蓖砬遽t(yī)家張振鋆與其族弟張地山著有《厘正按摩要術》-書中則提出了耳背分屬五臟的理論，指出“耳珠屬腎，耳輪屬脾，耳上輪屬心，耳皮肉屬肺，耳背玉樓屬肝”等耳與五臟分屬的生理聯(lián)系。因此，正如《衛(wèi)生寶鑒》指出的那樣:“五臟六腑，十二經脈皆有絡于耳者?！?/p>

本課題組以往研究顯示，耳甲腔穴位胰膽電針刺激能影響孤束核葡萄糖敏感神經元以及胰島素敏感神經元的自發(fā)性放電頻率〔6〕;進一步采用逆行神經示蹤法研究發(fā)現(xiàn)，耳甲腔迷走神經耳支末梢與孤束核以及迷走神經背核具有投射關聯(lián)〔7〕，據(jù)此推測耳針作用機制可能與興奮迷走神經有關。Tracy等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經刺激或采用膽堿能激動劑可促使神經末梢釋放乙酰膽堿并作用于炎性細胞表面的乙酰膽堿的N型受體α7亞單位(α7nAChR)，抑制炎癥因子，如 IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α等及趨化因子合成和釋放，從而降低或阻止局部或全身的炎癥反應，這一機制被命名為“膽堿能抗炎通路”。前期研究顯示，電針耳甲區(qū)穴位(有迷走神經耳支分布)可降低2型糖尿病模型大鼠循環(huán)血液中促炎因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α以及C-反應蛋白(CRP)的水平，并改善胰島素抵抗指數(shù)，據(jù)此推測耳針刺激可能具有與迷走神經刺激相類似的膽堿能抗炎效應〔4〕。

本研究結果提示耳針血清對血管內皮細胞具有顯著的保護作用。進一步實驗發(fā)現(xiàn)膽堿能M受體阻斷劑阿托品對耳針保護作用無影響，而N型AchR阻斷劑六烴季銨組和N型AchR α7亞單位拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素則則能夠阻斷耳針血清的保護效應。據(jù)此推測耳針效應可能是通過興奮迷走神經，并促進乙酰膽堿的釋放及與其AchR α7亞單位結合而介導的。這一結果與李建國等〔9〕針刺足三里激活膽堿能抗炎通路抗大鼠失血性休克的研究結果類似。

本文所采用的“針刺血清”的方法是受“血清藥理學”和“中藥血清學”的啟發(fā)而提出的，該方法與以往在體實驗檢測針灸后的人或動物血清成分含量及其變化相比，可排除體內多因素的影響，獲得了較為理想的結果，克服了在體實驗的局限性〔10〕。然而，對于針刺血清來源、血清有效部位及其作用對象和作用途徑等，學界尚未達成一致的共識，因此關于針刺血清實驗方法尚待進一步規(guī)范與改進。

1 王 慧，婁晉寧.糖尿病微血管病變機制的研究進展〔J〕.醫(yī)學研究雜志，2010;39(8):101-4.

2 鄭真真，夏玉卿，朱 兵，等.針刺耳迷走神經點降低高血糖即時效應的臨床觀察〔J〕.中國針灸，2008;28(9):702.

3 黃 鳳，榮培晶，王宏才，等.耳甲迷走神經刺激干預35例糖耐量受損者臨床觀察〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2010;25(12):2185-6.

4 Mei ZG，Zeng YB，Liu XJ，et al.Efficacy of auricular acupuncture on inflammatory markers and insulin resistance in type 2 diabetes model of rats:in light of cholinergic anti-inflammatory pathway.In:Proceedings of 2011 international conference on human health and biomedical engineering〔M〕.New Jersey:IEEE，2011:1236-41.

5 葛金文，梅志剛，朱惠斌.一種新的Ⅱ型糖尿病血管并發(fā)癥細胞研究模型:葡萄糖、胰島素、低密度脂蛋白聯(lián)合誘導血管內皮細胞損傷的研究〔J〕.血栓與止血學，2005;11(6):245-9.

6 梅志剛，李艷華，朱 兵，等.孤束核葡萄糖敏感神經元、胰島素敏感神經元對耳甲刺激的反應〔J〕.中國針灸，2007;27(12):917-22.

7 梅志剛，何 偉，朱 兵，等.耳針作用的形態(tài)學基礎——來自HRP神經示蹤法的證據(jù)〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2009;20(11):2675-7.

8 Tracy KJ.The inflammatory reflex〔J〕.Nature，2002;420:853-9.

9 李建國，彭周全，杜朝暉，等.電針足三里激活膽堿能抗炎通路抗大鼠失血性休克的研究〔J〕.中國中西醫(yī)結合急救雜志，2006;13(1):27-31.

10 趙英俠，王 靜，秦逸人，等.針灸血清作用的研究概況〔J〕.上海針灸雜志，2005;24(12):40-2.