白星子 王國賢 李 飛 (遼寧醫(yī)學(xué)院藥理教研室，遼寧 錦州 121001)

糖尿病腦病是糖尿病引發(fā)的一種獨(dú)特性的慢性并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病晚期死亡的原因之一。α-硫辛酸具有強(qiáng)抗氧化作用、保護(hù)β細(xì)胞，延續(xù)β細(xì)胞衰減，減輕對(duì)β細(xì)胞攻擊;增強(qiáng)葡萄糖利用，增強(qiáng)胰島素敏感性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功效。藥理和臨床發(fā)現(xiàn)它具有治療糖尿病及并發(fā)癥的作用。本研究通過建立糖尿病模型，觀察不同劑量α-硫辛酸干預(yù)后腦皮質(zhì)中核因子(NF)-κB、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)蛋白水平變化，探討α-硫辛酸對(duì)糖尿病大鼠大腦皮質(zhì)的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 α-硫辛酸(美國Sigma公司)，將α-硫辛酸溶于生理鹽水中配成所需濃度。鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)。SureStep Plus血糖檢測儀(美國強(qiáng)生公司)。ELISA試劑盒(北京博奧森公司)。兔抗鼠 NF-κB、GFAP、RAGE抗體(北京博奧森公司)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 健康SD大鼠(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)50只，雄性180～200 g，SCXK(遼)2003-2008。對(duì)照組10只大鼠給予普通飲食1個(gè)月后腹腔注射等體積的不含STZ的檸檬酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)組40只大鼠給予高脂高糖飲食1個(gè)月后腹腔注射小劑量的鏈尿佐菌素30 mg/kg。72 h后尾靜脈取血測定血糖，將血糖濃度≥16.7 mmol/L大鼠定為糖尿病造模成功，低于此值者棄去。將造模成功36只大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、α-硫辛酸低、中、高劑量組，每組9只。糖尿病模型組不予任何干預(yù)，α-硫辛酸組分別給予 α-硫辛酸15、30、60 mg/kg灌胃。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 血糖及血清糖化血紅蛋白、AGEs含量測定 采用SureStep Plus血糖儀于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前檢測空腹血糖。干預(yù)給藥結(jié)束后，大鼠頸動(dòng)脈取血，離心分離血清(3 h內(nèi))，勻漿上清液蛋白，采用比色法檢測大鼠血清糖化血紅蛋白、AGEs含量。

1.3.2 石蠟切片HE染色 將一半大腦皮質(zhì)置于10%的甲醛并用石蠟包埋，做成連續(xù)切片，按HE染色常規(guī)操作進(jìn)行，觀察每組大腦皮質(zhì)在光鏡下的形態(tài)特征及其變化。

1.3.3 腦皮質(zhì)中NF-κB、GFAP、RAGE表達(dá) 采用免疫組化方法，石蠟防脫切片60℃烤片90 min，常規(guī)脫蠟至水洗，高壓6.0熱修復(fù)抗原，滴加正常羊血清封閉液，滴加1∶100稀釋一抗，滴加生物素化二抗、組織和細(xì)胞抗原免疫組化顯色試劑(Strept Actividin-Biotin Complex，SABC)、DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。對(duì)照用PBS代替Ⅰ抗。采用CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測量切片NF-κB、GFAP、RAGE累計(jì)吸光度值(A)。

1.3.4 NF-κB、RAGE蛋白含量測定 采用Western印跡法，取-80℃凍存心肌標(biāo)本100 mg加入裂解液中剪碎后移入1.5 ml環(huán)氧樹脂管中，4℃ 12 000 r/min離心25 min，取上清液用于蛋白定量。SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，恒壓電泳95 V，室溫1 h，4℃封閉過夜，按0.1 ml/cm2膜面積加入1∶500一抗，雜交2 h，封閉液漂洗后按0.1 ml/cm2膜面積加入1∶500二抗，室溫下?lián)u床雜交1 h，漂洗后加顯色劑5 min，放射顯影。用生物凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描定量。

2 結(jié)果

2.1 α-硫辛酸對(duì)大鼠血糖、糖化血紅蛋白及血清AGEs含量影響 大鼠注射STZ后血糖水平明顯升高，糖尿病模型組大鼠呈明顯多飲、多食、多尿癥狀，并伴不同程度精神萎靡。α-硫辛酸組大鼠一般情況較好，癥狀較模型組明顯減輕。3只大鼠未成模，1只大鼠死亡。病程12 w時(shí)，與對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血糖、糖化血紅蛋白及血清AGEs含量明顯升高;α-硫辛酸各劑量組血糖、糖化血紅蛋白及血清AGEs含量較糖尿病模型組大鼠有所改善，尤以中劑量組改善最為明顯。見表1。

表1 血糖、糖化血紅蛋白、血清中的AGEs變化(s)

表1 血糖、糖化血紅蛋白、血清中的AGEs變化(s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與糖尿病模型組比較:2)P＜0.05;與 α-硫辛酸15 mg/kg組比較:3)P ＜0.05，下表同

組別 n 血糖 糖化血紅蛋白10 4.62±1.03 5.61±0.10 0.02±0.001糖尿病模型組 9 25.45±3.24 11.54±3.991) 0.19±0.0081)α-硫辛酸15 mg/kg 9 14.69±1.771) 10.04±0.241) 0.15±0.011)30 mg/kg 9 12.26±1.672)3) 6.78±0.172)3) 0.07±0.0032)3)60 mg/kg 9 13.45±0.392) 8.01±0.251)2) 0.10±0.021)AGEs對(duì)照組

2.2 腦皮質(zhì)形態(tài)學(xué)改變 HE染色光鏡下觀察大鼠大腦皮質(zhì)組織切片。與對(duì)照組比較，糖尿病大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)目減少并呈退行性病變，神經(jīng)元胞體增大，神經(jīng)元層次不完整，核固縮形狀不規(guī)則;α-硫辛酸各劑量組較糖尿病組改善明顯，神經(jīng)元數(shù)目增多。

2.3 α-硫辛酸對(duì)大鼠NF-κB、GFAP、RAGE影響 與對(duì)照組比較，糖尿病模型組 NF-κB、GFAP、RAGE比值均明顯降低(t=3.015，P＜0.05);與糖尿病模型組比較，α-硫辛酸各劑量組NF-κB、GFAP、RAGE比值有不同程度升高，尤以中劑量組升高最為明顯(t=3.815，P＜0.05)。見表2。

2.4 NF-κB、RAGE的Western印跡檢測 見表3，圖1。與對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠心肌NF-κB、RAGE蛋白表達(dá)明顯增高(t=4.048，P＜0.05)，α-硫辛酸各干預(yù)組大鼠心肌 NF-κB、RAGE蛋白表達(dá)明顯低于糖尿病模型組，尤以中劑量組降低明顯(t=3.017，P ＜0.05)。

表2 各組NF-κB、GFAP、RAGE表達(dá)變化(s)

表2 各組NF-κB、GFAP、RAGE表達(dá)變化(s)

10 2.40±0.03 160.38±11.10 3.32±9.61糖尿病模型組 9 0.18±0.44 121.51±3.991) 0.39±0.081)α-硫辛酸15 mg/kg 9 1.49±0.172) 137.10±5.151) 1.29±0.151)30 mg/kg 9 2.26±0.072)3)160.12±1.172)3)2.87±0.032)3)60 mg/kg 9 1.65±0.032) 155.01±5.251)2) 1.68±0.121)GFAP RAGE對(duì)照組組別 n NF-κB

圖1 各組NF-κB、RAGE 表達(dá)

表3 各組NF-κB、RAGE蛋白表達(dá)結(jié)果(s)

組別(mg/kg)n NF-κB 10 1.83±0.14 0.61±0.02糖尿病模型組 8 9.17±0.251) 5.69±0.411)α-硫辛酸 15 mg/kg 9 8.02±0.131)2) 4.86±0.421)2)30 mg/kg 9 4.92±0.14 61)2)3) 2.51±0.321)2)3)60 mg/kg 9 6.66±0.151)2)3) 4.20±0.361)2)3)RAGE對(duì)照組

3 討論

糖尿病性腦病是由于長期慢性糖代謝紊亂損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使大腦在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及神經(jīng)精神等方面發(fā)生病理改變，以獲得性認(rèn)知行為缺陷為特征的糖尿病慢性并發(fā)癥〔1〕。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為高血糖是常見的原因。血糖增高可以引起血清中的AGEs的濃度增高，AGEs與腦皮質(zhì)中的RAGE結(jié)合，能夠引發(fā)NF-κB的持續(xù)活化，進(jìn)而使腦皮質(zhì)退行性病變〔2，3〕。高血糖亦可引起GFAP濃度的增高，可以浸潤腦皮質(zhì)，與腦皮質(zhì)損傷有密切關(guān)系〔4〕。

α-硫辛酸被譽(yù)為“萬能抗氧劑”〔5〕，它廣泛分布于動(dòng)植物等生物組織中，易被生物組織吸收利用，具有較強(qiáng)的抗氧化性，并且能通過血腦屏障，對(duì)很多腦和神經(jīng)衰退性疾病可能都有一定的防治作用，但是對(duì)于糖尿病腦皮質(zhì)方面的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸可以改善糖尿病大鼠大腦皮質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變，不但能降低血清中的AGEs的濃度，而且能夠下調(diào)糖尿病大鼠大腦皮質(zhì)中的NF-κB、GFAP、RAGE的表達(dá)，從而減少腦皮質(zhì)的損傷，對(duì)于治療糖尿病腦病有重要的意義。

1 Biessels GJ，van der Heide LP，Kamnal A，et al.Ageing and diabetes:implications for brain function〔J〕.Eur J Pharmacol，2002;441(1):1.

2 張怡村，徐善水.NF-κB在腦缺血缺氧再灌注損傷中的雙重作用〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2008;7(6):638.

3 Chen B，Liao WQ，Xu N，et al.Adiponcctin protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through anti-inflammatory action〔J〕.Brain Res，2009;1273(4):129.

4 Baydas G，Nedzvetskii VS，Tuzcu M，et al.Increase of glial fibrillary acidic protein and S-100B in hippocampus and cortex of diabetic rats:effects of vitamin E〔J〕.Eur J Pharmacol，2003;462:67-71.

5 賈一韜，韋 多.硫辛酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞核因子κB活性的抑制作用〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2006;31(11):1074-6.