王曉萍 吳 蔚 邵 冰 宋平南 孫 琳

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院心血管一病房，遼寧 沈陽(yáng) 110002)

病態(tài)竇房結(jié)綜合征是一種常見(jiàn)心律失常，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至可導(dǎo)致心源性猝死。盡管電子起搏器、阿托品或心迷走神經(jīng)消融術(shù)在治療該病上有一定的效果，但仍具有使用或靶向較差的不足，故急需探索有效簡(jiǎn)單且并發(fā)癥較小的治療方法〔1～3〕。近年來(lái)生物起搏器研究已成為緩慢心律失常治療領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。Kv2.1通道是竇房結(jié)、心房和房室結(jié)興奮的主要調(diào)節(jié)蛋白，該通道屬于內(nèi)向整流鉀通道，通道是由四個(gè)α亞單位構(gòu)成的功能性內(nèi)向整流鉀通道，在起搏電位的發(fā)生中具有重要作用〔4，5〕。Kir2.2基因可編碼心臟Kv2.1通道中α亞單位的基因〔6〕，故推測(cè)可從分子水平對(duì)Kir2.2基因進(jìn)行干擾治療，使Kv2.1通道失活，從而阻斷其在緩慢性心律失常中的作用，達(dá)到治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的目的。本研究探討慢病毒介導(dǎo)RNA干擾心房區(qū)心肌細(xì)胞Kir2.2基因?qū)v2.1鉀通道及內(nèi)向整流鉀電流的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 二甲亞砜(DMSO)、胎牛血清、TritonX100，美國(guó)Sigma公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記鼠二抗單克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司;Kv2.1多克隆抗體，美國(guó)Cell Sigaling Technology公司;PCR試劑盒，Biouniquer公司;RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司);脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，上海Invitrogen公司;慢病毒包裝系統(tǒng)pGCSIL-綠色熒光蛋白(GFP)載體和 pHelper1.0載體、pHelper2.0載體，Gene script公司;小干擾序列以及引物，上海吉?jiǎng)P公司;小干擾序列以及引物，上海吉?jiǎng)P公司;M-MLVRTase、質(zhì)粒抽提試劑盒，美國(guó)Promega公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒，碧云天生物科技公司;DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 心房區(qū)心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取1～3日齡的Wistar大鼠，于無(wú)菌環(huán)境下剪取心臟，保留心房，并置于預(yù)冷的D-Hank溶液中漂洗干凈。用眼科小彎將組織充分剪碎，加入5倍體積的0.08%胰蛋白酶溶液消化3～5 min(37℃)，靜置后棄上清，將沉淀再加入約5倍體積0.08%胰蛋白酶及0.1%膠原酶混合液，將上清液移入離心管，反復(fù)吹打至無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊后，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心處理10 min，棄掉上清后將細(xì)胞重懸于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，按1×105個(gè)/ml將細(xì)胞接種于10 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每8～12 h更換培養(yǎng)液。

1.2.2 pGCSIL-GFP/Kir2.2-siRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定根據(jù)GenBank中 Kir2.2序列，利用 siRNA sequence selector設(shè)計(jì)針對(duì)Kir2.2特異性siRNA序列，siRNA插入序列正義鏈:5'-TATTCTTGGAGAGGCCATGTA-3'，反義鏈:5'-GTCTGAGGTGCGTATCATA-3'。將靶向Kir2.2基因的siRNA表達(dá)序列連接到慢病毒載體pGCSIL中，獲得pGCSIL-Kir2.2-siRNA重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。pGCSIL-GFP-siRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方式相同。

1.2.3 攜帶Kir2.2基因重組慢病毒的包裝和病毒滴度的測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞用0.25%胰酶消化處理，并以1.0×107個(gè)/ml的密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)染前提前2 h將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度約70%時(shí)，將重組慢病毒骨架質(zhì)粒與包裝輔助質(zhì)粒用LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染至293T包裝細(xì)胞，48 h后收集病毒上清液，4℃ 4 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片，濾器過(guò)濾上清液并進(jìn)行濃度處理。用逐孔稀釋滴度測(cè)定法在293T細(xì)胞中測(cè)定病毒滴度。病毒滴度(TU/ml)=GFP陽(yáng)性細(xì)胞率×細(xì)胞總數(shù)/(慢病毒液體積×慢病毒液稀釋倍數(shù))。

1.2.4 重組慢病毒轉(zhuǎn)染心房區(qū)心肌細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞，0.25%胰酶消化處理，以1×105/ml的密度將心肌細(xì)胞接種至6孔板中。培養(yǎng)12 h后，用LipofectamineTM2000分別將質(zhì)粒pGCSIL-GFP-siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做對(duì)照。3 d采用熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況。

1.2.5 RT-PCR鑒定Kir2.2沉默效果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為三組:Control組(不行慢病毒轉(zhuǎn)染)、Ad-siRNA-null組(僅行空慢病毒轉(zhuǎn)染)和Ad-siRNA-Kir2.2組(行pGCSIL-Kir2.2-siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染)。于感染后依據(jù)提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果表示為Kir2.2與GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)差。Kir2.2上游:5'-GGAGCGTGGCAACAGATAG-3';下游:5'-TCTCCCCCTTATTTGCTTCTTC-3'。GAPDH 上 游:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3';下游:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

1.2.6 Western印跡實(shí)驗(yàn) 采用常規(guī)方法收集對(duì)數(shù)期心肌細(xì)胞，加入全蛋白提取緩沖液充分裂解細(xì)胞;高速離心12 000 r/min 20 min，取上清并測(cè)定蛋白濃度BCA法，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳。電泳條件:濃縮膠恒壓80 V約20 min，分離膠100 V約80 min。半干轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，Kv2.1的稀釋比例為分別為1∶200。4℃孵育過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗PVDF膜，加入二抗(稀釋比例1∶3 000)。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)來(lái)顯色處理，膠片曝光后觀察蛋白的條帶，最終結(jié)果為為與GAPDH條帶光密度的比值。

1.2.7 全細(xì)胞膜片鉗記錄 全細(xì)胞膜片鉗記錄方法參照文獻(xiàn)〔7〕報(bào)道:選用橫紋肌清晰的心肌細(xì)胞，將拉制好的玻璃微電極(2～5 mΩ)形成高阻抗封接后，負(fù)壓破膜，并行全細(xì)胞記錄。在電壓鉗制下記錄離子通道電流，信號(hào)經(jīng)過(guò)膜片鉗放大器、模數(shù)轉(zhuǎn)換器采集、貯存和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以s表示，兩組之間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及滴度測(cè)定 Kir2.2-siRNA核苷酸鏈序列插入正確，成功構(gòu)建了針對(duì)大鼠Kir2.2-siRNA的siRNA，病毒測(cè)定滴度為2.1×109TU/ml。

2.2 病毒顆粒感染心房區(qū)心肌細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞形態(tài)較好，呈單層生長(zhǎng)，均勻分布。用攜帶報(bào)告基因GFP的慢病毒載體(pGCSIL-GFP-siRNA)感染心房區(qū)心肌細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光，超過(guò)80%的細(xì)胞均可檢測(cè)GFP(MOI=50)，載體可正確表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.3 RNA干擾對(duì)Kir2.2基因表達(dá)的影響 與Control組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的Kir2.2 mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Ad-siRNA-null組的Kir2.2 mRNA水平與Control組無(wú)差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1，圖2A。

2.4 RNA干擾對(duì)Kv2.1鉀通道水平的影響 與Control組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的Kv2.1鉀通道蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Ad-siRNA-null組的Kv2.1鉀通道蛋白水平與Control組無(wú)差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1，圖2B。

圖1 pGCSIL-GFP-siRNA感染心房區(qū)心肌細(xì)胞后GFP的表達(dá)情況(×100)

圖2 RNA干擾對(duì)Kir2.2基因表達(dá)和Kv2.1鉀通道水平的影響

表1 三組的Kir2.2基因表達(dá)和Kv2.1鉀通道水平(s)

表1 三組的Kir2.2基因表達(dá)和Kv2.1鉀通道水平(s)

與Control組比較:1)P＜0.05;與Ad-siRNA-null組比較:2)P＜0.05

Kir2.2 mRNA Kv2.1 0.54±0.12 0.81±0.16 Ad-siRNA-null組 0.57±0.14 0.79±0.83 Ad-siRNA-Kir2.2組 0.32±0.061)2) 0.53±1.311)2)Control組蛋白組別

2.5 RNA干擾對(duì)Ik1峰值電流密度的影響 Ad-siRNA-Kir2.2組的峰值電流密度為(-73.66±8.57)pA/pF，Control組和AdsiRNA-null組分別為(-142.85±15.72)pA/pF和(-139.63±14.86)pA/pF，Ad-siRNA-Kir2.2組的IK1減弱，峰值電流密度低于其余兩組(P＜0.05)，Control組和Ad-siRNA-null組無(wú)差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖3A。

2.6 RNA干擾對(duì)Ik1的電流-電壓曲線的影響 與Control組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的電流-電壓曲線上移;內(nèi)向電流(-100 mV)降低(23.48±5.67)% ，外向電流降低(31.09±6.27)%;與Ad-siRNA-null組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的電流-電壓曲線上移;內(nèi)向電流(-100 mV)降低(22.95±5.73)%，外向電流降低(32.64±6.81)%;Control組和Ad-siRNA-null組無(wú)差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖3B，3C。

圖3 三組的Ik1相關(guān)指標(biāo)情況

3 討論

安裝電子起搏器是目前治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的主要方法，但該方法存在感染、壽命短須定期更換等缺陷〔1〕?？诜⑼衅坊蛐拿宰呱窠?jīng)消融可使多數(shù)病人心率明顯提高而避免安裝起搏器〔2，3〕。然而前者使用麻煩、存在多種副作用，后者消融靶點(diǎn)不易確定，且并發(fā)癥多。近年來(lái)生物起搏器研究已成為緩慢心律失常治療領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

基因治療是通過(guò)借助質(zhì)?；虿《据d體來(lái)對(duì)某個(gè)或某些基因的水平進(jìn)行調(diào)整來(lái)達(dá)到影響基因生理功能的方法〔8〕，有望成為生物起搏器的實(shí)現(xiàn)形式。Edelberg等〔9〕首先用整合了編碼β2-腎上腺素受體基因的質(zhì)粒注射到豬心房區(qū)使心率明顯增快，對(duì)β-腎上腺素刺激的反應(yīng)明顯超過(guò)對(duì)照組，提示基因治療具有可行性。過(guò)表達(dá)Kir2.1(編碼轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)向整流電流IK1通道Kv2.1的1個(gè)α亞單位基因)，下調(diào)外向超極化電流使內(nèi)向電流引起膜除極化，從而產(chǎn)生起搏電位〔10〕，提示Kv2.1在起搏電位的發(fā)生中具有重要作用;鑒于Kir2.2基因也參與編碼Kv2.1的一個(gè)α亞單位，因此推測(cè)通過(guò)RNAi的手段下調(diào)新房區(qū)心肌細(xì)胞Kir2.2基因表達(dá)，可阻斷其編碼的Kv2.1鉀通道的形成，從而阻斷心迷走神經(jīng)介導(dǎo)的負(fù)性心率及負(fù)性心臟傳導(dǎo)作用。

本研究采用慢病毒載體來(lái)構(gòu)建攜帶Kir2.2基因干擾RNA載體，具有表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定性好及可整合入宿主細(xì)胞基因組等優(yōu)點(diǎn)〔11，12〕，廣泛用于研究特定基因過(guò)表達(dá)、基因沉默及啟動(dòng)子的調(diào)控〔13～15〕。因此，本研究成功構(gòu)建攜帶Kir2.2基因的小干擾RNA的慢病毒載體，測(cè)序發(fā)現(xiàn)序列插入正確，而熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有GFP表達(dá)，表明載體可在心肌細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。與Control組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的Kir2.2基因的mRNA水平下降，表明干擾后的細(xì)胞Kir2.2基因的表達(dá)受到明顯抑制，提示在通過(guò)RNA干擾來(lái)下調(diào)Kir2.2基因表達(dá)可行。采用Western blot觀察發(fā)現(xiàn):Ad-siRNA-Kir2.2組的Kv2.1鉀通道的蛋白水平低于Control組，表明針對(duì)Kir2.2基因的RNA干擾可降低Kv2.1鉀通道的蛋白水平，主要的原因是Kir2.2基因表明該蛋白的一個(gè)亞基，故下調(diào)Kir2.2基因的表達(dá)可降低Kv2.1鉀通道的蛋白水平。本研究的另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是Ad-siRNA-Kir2.2組的內(nèi)向整流鉀電流受到抑制，如電流密度降低，且電流-電壓曲線上移，內(nèi)向電流(-100 mV)和外向電流(-60 mV)均降低，提示下調(diào)Kir2.2基因的表達(dá)可抑制內(nèi)向整流鉀電流，主要與其降低Kv2.1鉀通道的蛋白水平有關(guān)。

綜上所述，慢病毒介導(dǎo)RNA干擾心房區(qū)心肌細(xì)胞Kir2.2基因可降低Kv2.1鉀通道的表達(dá)并抑制內(nèi)向整流鉀電流，具有一定的潛在臨床價(jià)值。從細(xì)胞及整體水平探索以基因治療為基礎(chǔ)的生物起搏器治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的新途徑，為改善緩慢性心律失?；颊呱钯|(zhì)量及彌補(bǔ)電子起搏器的不足提供新思路。

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