李 艷 曹文富 (重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(TGF-β1R)是目前已知致肝纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子，在形成肝纖維化的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用〔1〕。TGF-β1R 又是通過(guò)結(jié)合 TGF-β1R 來(lái)發(fā)揮作用〔2〕。肝纖維化的中醫(yī)病機(jī)眾多中醫(yī)界人士認(rèn)為其中心環(huán)節(jié)是痰濁膠結(jié)加之氣虛血瘀促成。近年一些文獻(xiàn)報(bào)道有采用益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法治療肝纖維化，以及四種方法結(jié)合治療肝纖維化的文獻(xiàn)報(bào)道。但是，益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法四種方法單獨(dú)應(yīng)用和合用到底有什么療效上的區(qū)別?我們?cè)谂R床應(yīng)用中到底如何在這幾種方法上進(jìn)行選擇仍然是臨床上困惑的問(wèn)題，而當(dāng)前對(duì)于它們之間療效有什么差別尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。理清這幾種治療，對(duì)于我們今后采用中醫(yī)中藥治療肝纖維化過(guò)程中，如何權(quán)衡選擇單獨(dú)劑量治療還是合用治療?對(duì)于我們判斷用藥的選擇具有非常重要的意義。而中醫(yī)、西醫(yī)在臨床應(yīng)用中到底如何在這幾種方法上進(jìn)行選擇仍然是臨床上困惑的問(wèn)題，而當(dāng)前對(duì)于它們之間療效有什么差別尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 雄性SD大鼠130只，清潔級(jí)，體重180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供〔許可證號(hào) syxk(渝)20070001〕。

1.2 藥物 (1)精選中藥黃芪、白術(shù)，混合水提并濃縮成益氣口服制劑(每毫升含生藥2 g);(2)精選中藥川芎、姜黃，混合水提并濃縮成化瘀口服制劑(每毫升含生藥2 g);(3)精選中藥半夏、海藻，混合水提并濃縮成化痰口服制劑(每毫升含生藥2 g);(4)精選中藥鱉甲、白芍，混合水提并濃縮成養(yǎng)陰口服制劑(每毫升含生藥2 g);(5)精選中藥黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲，混合水提并濃縮成益氣化瘀化痰養(yǎng)陰口服制劑(每毫升含生藥2 g)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 130只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只(純水灌胃)、肝纖維化模型組20只(純水灌胃)、益氣組20只(益氣劑灌胃)、化瘀組20只(化瘀劑灌胃)、化痰組20只(化痰劑灌胃)、養(yǎng)陰組20只(養(yǎng)陰劑灌胃)、益氣化瘀化痰養(yǎng)陰組20只(益氣化瘀化痰養(yǎng)陰劑灌胃)。

1.3.2 造模方法 除正常對(duì)照組大鼠給予正常普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組大鼠(1)給予39.5%玉米面+40%面粉+20%豬油+0.5%膽固醇組成的高脂低蛋白飼料。(2)采用背部皮下注射CCL4油劑，每周2次，共計(jì)12 w。第1周的2次皮下注射劑量皆為0.5 ml/100 g體重，以后每次注射劑量為0.3 ml/100 g體重，安排每周星期二和星期五進(jìn)行。建立肝纖維化大鼠模型，并將試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分入相應(yīng)各組。(3)每天5%酒精作為唯一飲料。

1.3.3 給藥方法 (1)各組實(shí)驗(yàn)大鼠中藥制劑均按約3 ml/100 g劑量灌胃。(2)肝纖維化模型組:20只大鼠生理鹽水灌胃(劑量約3 ml/100 g)。(3)正常對(duì)照組:10只大鼠生理鹽水灌胃(劑量約3 ml/100 g)。

1.3.4 標(biāo)本留取 最后一次用藥后24 h，麻醉大鼠，斷頭處死大鼠取肝臟，取部分肝組織用10%中性甲醛溶液或二醛-鋨酸雙重固定，待做免疫組化或電鏡檢查，其余標(biāo)本于液氮中冷凍后再轉(zhuǎn)移到-70°冰箱中保存。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 肝組織形態(tài) 采用HE染色法，光鏡觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、肝板排列、中央靜脈等。

1.4.2 Masson三色膠原染色 切片脫蠟后于0.5%碘酒精作用10 min，稍水洗，5%硫代硫酸鈉作用5 min，流水沖洗10 min，Weiger氏鐵蘇木素染5～10 min，流水稍洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)min，麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水稍沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理約5 min，苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min，梯度脫水，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。

1.4.3 RT-PCR法檢測(cè)肝組織TGF-β1R mRNA表達(dá) 提取大鼠肝組織總RNA，然后在42℃ 20 min條件下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。于Genebank中查的大鼠TGF-β1R和GAPDH整個(gè)核酸序列，利用Premier5.0查得其引物并合成，退火溫度55℃。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物再濃度為1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。在紫外燈光下觀察電泳結(jié)果。凝膠在Bio-Rad公司所生產(chǎn)的凝膠成像儀上用Quantityone4.6圖像分析軟件進(jìn)行照相分析。各條帶的相對(duì)光密度值=目的條帶光密度值/內(nèi)參GAPDH條帶光密度值。GAPDH:上游:GTGGAGTCTACTGGCGTCTT;下游:GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT，擴(kuò)增 275 bp TGF-βR1:上游:CCTGCTTCTCATCGTGTT下游:CTTTGTTGTCTGCTGCTAT，擴(kuò)增548 bp。

1.4.4 Western印跡法檢測(cè)肝組織TGF-β1R蛋白表達(dá) 行為檢測(cè)后，直接斷頭處死大鼠取肝臟后凍于-70℃冰箱。稱取一定量的肝臟組織，進(jìn)行裂解和BCA蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。30 g蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，3%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過(guò)夜，TBS-Tween洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，經(jīng)EC檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組TGF-β1R蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用用方差分析和LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肝組織形態(tài)學(xué) 光鏡下，正常組大鼠肝組織形態(tài)規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè)無(wú)基底膜存在，肝星狀細(xì)胞呈梭形或桿狀，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)無(wú)擴(kuò)大，無(wú)纖維組織存在及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠肝臟匯管區(qū)擴(kuò)大，纖維組織顯著增生，多數(shù)形成假小葉，肝細(xì)胞變性壞死，肝纖維化程度分期顯著增高;各治療組大鼠肝細(xì)胞變性壞死、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和肝纖維化程度減低。見(jiàn)圖1。

2.2 Masson三色膠原染色結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠肝組織切片顯示，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，其周圍無(wú)明顯膠原纖維沉積。模型組表現(xiàn)為重度脂肪變，肝血竇擴(kuò)張、充血、水腫，匯管區(qū)纖維纖維組織增生非常明顯，肝內(nèi)膠原纖維組織增生明顯。益氣組可見(jiàn)肝血竇擴(kuò)張、充血、水腫，肝細(xì)胞中度-重度脂肪變，肝內(nèi)膠原纖維組織輕度增生?；鼋M和化痰組均可見(jiàn)匯管區(qū)膠原纖維組織中度增生。養(yǎng)陰組可見(jiàn)匯管區(qū)和肝內(nèi)膠原纖維組織輕度增生。益氣化瘀化痰養(yǎng)陰共同治療組肝細(xì)胞變化不明顯，肝內(nèi)膠原纖維組織輕度增生。見(jiàn)圖2。

2.3 RT-PCR檢測(cè) TGF-β1R mRNA的表達(dá) 與模型組(2.343 6±0.184 3)相比，治療組益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法中大鼠肝組織 TGF-β1R基因表達(dá)降低(1.964 7±0.179 8，1.746 1±0.180 8，1.743 1 ±0.192 2，1.513 7 ±0.177 8，P ＜0.01)，其中養(yǎng)陰法與化瘀組、益氣組、化痰組相比，大鼠肝組織TGF-β1R基因表達(dá)相對(duì)明顯降低(P＜0.05)。與益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法組相比，益氣化瘀化痰養(yǎng)陰組中大鼠肝組織TGF-β1R基因表達(dá)明顯降低(1.060 3±0.161 6，P＜0.05)。正常對(duì)照組TGF-β1R mRNA為0.886 7±0.168 6。見(jiàn)圖3。

2.4 Western印跡法檢測(cè)肝組織TGF-β1R蛋白表達(dá) 與模型組(1.826 7±0.080 8)相比，治療組益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法中大鼠肝組織 TGF-β1R蛋白表達(dá)降低(1.533 3±0.130 1，1.266 7±0.075 7，1.326 7 ±0.041 6，1.006 7 ±0.061 1，P ＜0.01)，其中養(yǎng)陰法與化瘀組、益氣組、化痰組相比，大鼠肝組織TGF-β1R蛋白表達(dá)相對(duì)明顯降低(P＜0.05)。與益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法組相比，益氣化瘀化痰養(yǎng)陰組中大鼠肝組織TGF-β1R蛋白表達(dá)明顯降低(0.540 0±0.052 9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常對(duì)照組TGF-β1R蛋白表達(dá)量為0.346 7±0.061 1。見(jiàn)圖4。

圖1 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對(duì)肝纖維化大鼠肝組織的HE染色(×400)

圖2 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對(duì)肝纖維化大鼠肝組織的Masson三色膠原染色(×400)

圖3 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1R mRNA的表達(dá)影響

圖4 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1R蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肝纖維化是肝組織對(duì)慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是多種類型細(xì)胞、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等一系列復(fù)雜作用的結(jié)果，以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的過(guò)度增生與異常沉積為主要特征〔3〕。肝纖維化作為一種慢性、進(jìn)行性、彌漫性的肝臟病變，治療不及時(shí)或治療不當(dāng)都可使其發(fā)展為肝硬化。許多文獻(xiàn)表明，TGF-β1是目前已知致肝纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子，在形成肝纖維化的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，而TGF-β1R通過(guò)結(jié)合TGF-β受體復(fù)合物來(lái)發(fā)揮作用，因此，TGF-β1R同樣作為肝纖維化程度參考的重要指標(biāo)〔1，2〕。Smads蛋白已被證實(shí)為 TGF-β 家族的特異性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)控著TGF-β家族的正、負(fù)反饋。許多文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β1R也可以依賴 Smad信號(hào)通路，來(lái)激活 PI3K、ERK、JNK、p38 信號(hào)通路〔4，5〕?？傊?，TGF-β1R 通過(guò)結(jié)合 TGF-β1 型受體激活MAPK和Smad信號(hào)通路促使肝星狀細(xì)胞活化，從而導(dǎo)致過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積最終導(dǎo)致肝纖維化〔6，7〕。因此說(shuō)明 TGF-β1R在肝纖維形成過(guò)程中起著重要的作用。

西藥治療肝纖維化的藥物雖然在臨床上取得一定的療效，但是出現(xiàn)的多種不良反應(yīng)而使其在臨床上應(yīng)用受到限制。近年來(lái)，中醫(yī)中藥抗肝纖維化顯現(xiàn)出了明顯的療效優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)及臨床研究顯示中藥多種單味中藥提取物或中藥復(fù)方都有確切的抗肝纖維化作用。本研究結(jié)果顯示，中草藥采用益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四種單劑治療法都可以降低肝組織內(nèi)纖維化程度，降低大鼠肝組織TGF-β1R基因和蛋白表達(dá)。益氣藥白術(shù)在臨床經(jīng)驗(yàn)配伍中起到較好的抗肝纖維化效果，同時(shí)現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黃芪可以顯著抑制實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠模型的肝纖維化，可以在蛋白水平增強(qiáng) MMP-2酶蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制TIMP-2酶蛋白的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的〔8〕。姜黃素為姜黃根莖中提取的天然色素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及抗病毒等生物學(xué)活性，并且近幾年的研究表明姜黃體外可抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖，降低α-SMA的表達(dá)并誘導(dǎo)其凋亡等功能，能夠明顯抑制肝纖維化形成〔9〕。姜黃素抑制肝纖維化大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成及肝臟TGF-β1R和PDGF的表達(dá)〔10〕。川芎之有效成分川芎嗪可能通過(guò)降低TGF-β的表達(dá)以及改善Smad3與Smad7之間的失衡，從而具有明顯的逆轉(zhuǎn)肝纖維化作用〔11〕。川芎能明顯抑制CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝組織肝纖維化組織中TGF-β1R表達(dá)，對(duì)肝組織有明顯的保護(hù)和治療作用〔12〕。有研究顯示，從海藻中提取物可能提高毛細(xì)血管內(nèi)脂蛋白脂酶活性并促進(jìn)該酶釋放，有效降低和降低肝臟總膽固醇TG、TC含量〔13〕。對(duì)于中藥鱉甲治療肝纖維化的研究更為廣泛，鱉甲提取物通過(guò)降低Ⅳ型膠原和Ⅲ型膠原的含量而發(fā)揮抗肝纖維化的作用〔14〕。從前述的諸多研究中，可以看出，四種單獨(dú)治療方法都有效緩解肝纖維化的功能。但是在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，在單獨(dú)應(yīng)用中，益氣法效果略差，化瘀與化痰兩者療效沒(méi)有明顯差異，其中養(yǎng)陰法又能體現(xiàn)更好的療效，說(shuō)明鱉甲、白芍具有更好的抗肝纖維化的作用。

肝纖維化根據(jù)中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域根據(jù)臨床癥候特點(diǎn)，可歸屬于中醫(yī)“脅痛”、“積聚”、“痰凝”、“黃疸”等病范疇。在我們的研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四種治療方法綜合應(yīng)用比單劑更能夠有效降低肝組織內(nèi)纖維化程度，降低TGF-β1R的基因和蛋白表達(dá)，說(shuō)明單獨(dú)治療雖然有效，減緩肝纖維化的嚴(yán)重程序，但是仍然不能發(fā)揮應(yīng)有的效果。如果綜合應(yīng)用四法，可以互相彌補(bǔ)各自的不足和欠缺，真正符合中醫(yī)理論“互根互用”的療效配伍理論體系。本實(shí)驗(yàn)以CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型為研究對(duì)象，觀察經(jīng)益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四種單劑和綜合應(yīng)用療后有效降低大鼠肝纖維組織學(xué)變化，有效達(dá)到干預(yù)TGF-β1R表達(dá)的影響。而綜合幾種方法的療效特點(diǎn)，說(shuō)明益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法可通過(guò)抑制TGF-β1R產(chǎn)生和表達(dá)，來(lái)抑制細(xì)胞外基質(zhì)形成和促進(jìn)ECM降解，改善肝組織器官代謝狀況等途徑，從而抑制與延緩肝纖維化的進(jìn)程，控制肝纖維化這類難治性疾病的進(jìn)展之目的。

總之，采用肝纖維因子的重要指標(biāo)作參考依據(jù)，評(píng)價(jià)益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法等治療肝纖維化的治療效果，對(duì)于深入闡釋中醫(yī)藥益氣化瘀化痰法治療肝纖維化的機(jī)制，不斷提高中醫(yī)藥防治肝纖維化的水平，促進(jìn)學(xué)科進(jìn)步具有重要意義。

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