楊雁鴻 周文文 唐利娟 齊曦明 侯燕燕 才麗娜 潘福棟 彭 勇

(秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤內科，河北 秦皇島 066000)

研究結果表明，內在的遺傳因素在環(huán)境因素的聯合作用下影響肺癌的發(fā)生。維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性與癌癥的發(fā)生有著密切聯系〔1〕。VDR是介導1，25(OH)2D3發(fā)揮生物效應的核內生物大分子，為類固醇激素、甲狀腺激素受體超家族成員。維生素D在正常肺組織內的抑制細胞生長、促進細胞分化的作用，這種功能受轉錄調節(jié)因子——VDR的調節(jié)。1，25(OH)2D3活性維生素D在體內具有多方面的活性，是維持鈣、磷平衡和骨代謝的主要激素之一。除此之外，1，25(OH)2D3在腫瘤的預防和治療方面也具有重要作用〔2～4〕。許多體內、體外實驗都證實了1，25(OH)2D3對肺癌的抑制作用〔5〕。VDR與肺癌相關性的研究目前國內尚未見報道。檢測的VDR基因多態(tài)性酶切位點分別為Apa1、Bsm1、Fok1和Taq1。本文探索VDR基因多態(tài)性酶切位點Apa1、Bsm1和Taq1與吸煙因素的單獨作用及兩者間交互作用，對非小細胞肺癌(NSCLC)發(fā)生的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2010年10月至2012年10月我院住院NSCLC患者144例為NSCLC組。其中鱗狀細胞癌66例、腺癌72例、腺鱗癌、大細胞癌及未分類癌共6例。其中男90例，女54例，年齡57～70歲，平均65.4歲，吸煙105例;對照組142例為健康體檢者，男92例，女50例，年齡55～74歲，平均66.0歲，吸煙71例。所有患者經病理學確診為原發(fā)性肺癌，無肺癌家族史和職業(yè)致癌物接觸史。兩組年齡、性別構成上均衡可比。根據Zhao等〔6〕研究將吸煙個體定義為吸煙或曾經吸煙大于100支以上。

1.2 研究方法 外周血DNA分離試劑盒，TaqDNA聚合酶及其緩沖液，4dNTPs，Apa1、Bsm1和 Taq1限制性內切酶，MarkerⅠDNA及l(fā)adder DL2000 Marker是Solarbio及天根生化科技有限公司產品。引物序列根據基因庫公布的VDR基因序列，并采用DNAman程序設計，由北京鼎國昌盛生物公司合成。根據酶切結果選取各個位點不同基因型的PCR產物進行測序(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)，以驗證擴增產物為目的片段并且確定基因型。

基因DNA取自外周血，采用外周血DNA分離試劑盒提取。Apa1位點PCR反應體系總量為25 μl，Bsm1位點PCR反應體系總量為 20 μl，Taq1 位點 PCR 反應體系總量為 25 μl，包含有基因組 DNA、引物 TaqDNA聚合酶緩沖液及0.5 μl的TaqDNA聚合酶。Apa1的上游引物為5'-AGGTCGGCTAGCTTCTGGATCATC-3'，下 游 引 物 為 5'-AGATCCTAAATGCACGGAGAAGTC-3'。Taq1的上游引物為5'-AGGTCGGCTAGCTTCTGGATCATC-3'，下 游 引 物 為 5'-AGATCCTAAATGCACGGAGAAGTC-3'。其反應條件如下:預變性 95℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共計35個循環(huán)。最后，一個循環(huán)為72℃10 min延伸。

Bsm1的上游引物5'-GGACCTGTGGCAACCAAGACT-3'，下游引物為5'-GCCCGCAAGAAACCTCAAATA-3'。通過編好程序的PCR儀進行PCR擴增，其循環(huán)條件如下:Bsm1位點PCR反應條件為預變性94℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 50 s，共計30個循環(huán)。最后，一個循環(huán)為72℃ 5 min延伸。各目的片段產物加入對應的限制性內切酶5 μl及其緩沖液，其產物在65℃恒溫箱16 h，然后對酶切產物電泳。

1.3 結果判斷 目的片段產物經Bsm1或Taq1酶切后電泳條帶可能出現3種情況:等位基因沒有酶切位點的純合子出現1個條帶，分別以兩個相應內切酶的第一個大寫字母表示其基因型，即分別表示為AA、BB或TT，只有一個酶切位點的雜合子出現3個條帶，分別以相應的大小寫字母表示其基因型，即Aa、Bb或Tt;有兩個酶切位點的純合子出現2個條帶，分別表示為aa、bb 或 tt。

1.4 統計學方法 采用SAS9.0軟件進行χ2檢驗和非條件Logistic回歸分析。

2 結果

2.1 酶切后電泳結果 Apa1、Bsm1和Taq1的各基因型的條帶數目及位置見圖1。

2.2 VDR基因型分布 Bsm1位點兩組bb、Bb基因型頻率分布差異不顯著(P＞0.05)。兩組的b、B等位基因頻率無差異(P＞0.05)。Apa1位點，兩組aa、Aa、AA基因型頻率分布差異顯著(P=0.032)。以Aa+AA基因型做參照，攜帶aa基因型可增加吸煙人群NSCLC的發(fā)病風險。兩組的a、A等位基因頻率差異顯著(P=0.009)，且與攜帶等位基因A相比攜帶等位基因a的個體可增加吸煙人群NSCLC的發(fā)病風險。Taq1位點，兩組tt、Ft、TT基因型頻率分布差異不顯著(P＞0.05)。兩組的t、T等位基因頻率差異不顯著(P=0.191)。見表2。

表1 兩組VDR的Apa1、Bsm1及Taq1基因多態(tài)性分布(n)

表2 兩組吸煙人群VDR基因3個位點基因型及等位基因的頻率分布〔n(%)〕

圖1 VDR-PCR產物經Apa1、Bsm1和Taq1酶切后的電泳圖

3 討論

預計于2015年我國將成為全球肺癌發(fā)病率最高的國家〔7〕。雖然有研究顯示，年齡不是肺癌的獨立預后因素〔8〕，但由于老年人各臟器功能減退，治療并發(fā)癥的發(fā)生常使老年人不能順利完成治療或放棄治療，從而影響老年肺癌患者的生存期。多項研究表明肺癌的發(fā)生是由環(huán)境暴露和個體的遺傳因素的相互作用而導致的多因素多階段的惡性疾病。致癌物在不同個體的活性差異可以達數十倍，個體的遺傳因素是一個重要原因〔1〕。

1，25(OH)2D3通過VDR介導發(fā)揮生物學效應，而VDR幾乎表達于所有的組織細胞。有資料表明，在肺癌細胞高表達的VDR與提高生存率有關〔9〕。有關肺癌組織和肺癌前病變VDR表達的實驗數據顯示，VDR在60%肺正常組織和61%肺化生組織中呈中-高度核表達。在肺癌組織中，VDR核表達為79%，62%的細胞質缺乏表達〔10〕。另外，一項關于人類癌癥的初步研究，應用免疫熒光技術測量VDR的表達，發(fā)現當正常細胞發(fā)生惡變時，VDR的表達數量也在發(fā)生改變，由此推測這一變化可以作為預測疾病發(fā)生的標志〔11〕。

Dogan等〔12〕發(fā)現降低VDR活性的Taq1多態(tài)性基因可能是患肺癌的危險因素，而年齡、性別、吸煙可能加重這一因素的影響。秦皇島位于中國河北省東北部，為暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候有關，可能與研究對象種族差異、接觸致癌因素差異、環(huán)境暴露因素及未知的混雜因素有關。有必要在其他人群中重復實驗以及進一步擴大樣本量驗證實驗結果。

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5 陳佳琦，張 力.維生素D對肺癌的抑制作用〔J〕.國際呼吸雜志，2010;30(22):1375-9.

6 Zhao D，Zhang XE，Guo YL，et al.Cyclooxygenase-2 Gly587Arg variant is associated with differential enzymatic activity and risk of esophageal squamous-cell carcinoma〔J〕.Mol Carcinog，2009;48(10):934-41.

7 中國抗癌協會肺癌專業(yè)委員會.2010中國肺癌臨床指南〔J〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:7.

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9 Srinivasan M，Parwani AV，Hershberge PA，et al.Nuclear vitamin D receptor expression is associated with improved survival in non-small cell lung cancer〔J〕.J Steroid Biochem Mol Biol，2011;123(1-2):30-6.

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12 Dogan I，Onen HI，Yurdakul AS，et al.Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and risk of lung cancer〔J〕.Med Sci Monit，2009;15:BR232-42.