趙 虹 駱慶和 殷 明 趙文娟 (上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

阿爾茨海默(AD)患者的迅速增加是當(dāng)前社會(huì)面臨的巨大挑戰(zhàn)，故對(duì)AD病理機(jī)制的研究及開(kāi)發(fā)有效的治療方法已成為了目前神經(jīng)退行性疾病研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。AD主要病理特征為大腦萎縮，在腦膜、大腦皮層及海馬的血管壁內(nèi)見(jiàn)有β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的老年斑(SP)〔1〕、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)及神經(jīng)元丟失〔2〕。大量研究表明，Aβ沉積和tau蛋白的NFTs在AD發(fā)病中起關(guān)鍵作用。海馬和大腦皮層區(qū)細(xì)胞外Aβ的聚集及細(xì)胞內(nèi)高磷酸化tau蛋白的神經(jīng)纖維樣纏結(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，從而引發(fā)病人漸進(jìn)性認(rèn)知障礙及記憶喪失。神經(jīng)元的喪失主要見(jiàn)于額，頂，大腦皮層。此處神經(jīng)元的喪失導(dǎo)致乙酰膽堿含量減少和膽堿乙酰化活性的減低，導(dǎo)致出現(xiàn)記憶和認(rèn)知功能障礙等臨床表現(xiàn)〔3〕。AD的病因和病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，受基因調(diào)控和多種環(huán)境因素影響，目前AD的發(fā)病機(jī)制尚不能完全闡明，也無(wú)有效治療方法。關(guān)于AD有許多假說(shuō)，包括膽堿能假說(shuō)，amyloid級(jí)聯(lián)反應(yīng)，氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等等。氧化應(yīng)激與AD有著密切的關(guān)系，AD的病因?qū)W中，其理論之一就是氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)。所以本文主要針對(duì)AD的氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)，闡述氧化應(yīng)激與AD的病理特征關(guān)系以及可能的作用，并提出關(guān)于氧化應(yīng)激的一些指標(biāo)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而對(duì)氧化應(yīng)激以及AD有更深的了解。

1 氧化應(yīng)激與自由基

氧化應(yīng)激(OS)的概念最早源于人類(lèi)對(duì)衰老的認(rèn)識(shí)。1956年，英國(guó)學(xué)者Harmna首次提出自由基衰老學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為自由基攻擊生命大分子造成組織細(xì)胞損傷，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因。1990年，美國(guó)衰老研究權(quán)威Sohal教授指出了自由基衰老學(xué)說(shuō)的種種缺陷，并首先提出了氧化應(yīng)激的概念。

自由基在某些生理生化過(guò)程發(fā)揮作用，在生理狀態(tài)下的自由基能夠刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。但是當(dāng)自由基的產(chǎn)生和清除的平衡狀態(tài)被破壞，導(dǎo)致自由基大量聚集，濃度過(guò)高會(huì)引起人體脂質(zhì)過(guò)氧化以及蛋白質(zhì)變性，從而對(duì)機(jī)體造成氧化損傷，形成各種不良結(jié)果，對(duì)人體造成危害〔4〕。

人體的腦組織是機(jī)體負(fù)荷氧最多的器官之一。雖然大腦的重量只占據(jù)人體體重的2% ～3%，但是消耗了供應(yīng)機(jī)體的20%的氧〔5〕。大腦神經(jīng)元的谷胱甘肽含量較少，而且只含有中等量的抗氧化酶，清除自由基的能力相對(duì)較弱〔6〕;大腦的神經(jīng)元的膜結(jié)構(gòu)是由高濃度的不飽和脂肪酸組成的，極易被氧化。此外，血腦屏障的存在阻礙了部分抗氧化物質(zhì)，使其不容易透過(guò)，因而使得人腦對(duì)氧化應(yīng)激特別敏感〔7〕。氧是人類(lèi)生存必需的元素，但如果體內(nèi)氧化還原平衡遭到破壞，多余的氧自由基會(huì)對(duì)身體造成氧化損傷，此類(lèi)氧化損傷直接參與了老年癡呆癥等多種神經(jīng)退行性疾病的病理過(guò)程。

2 OS與AD的病理特征

2.1 Aβ與OS效應(yīng) Aβ是SP的主要成分，是由β-淀粉樣多肽聚集于神經(jīng)軸突而形成。β淀粉樣多肽來(lái)源于一種跨膜蛋白-淀粉樣前體蛋白，非聚集的β淀粉樣多肽對(duì)人體沒(méi)有損傷作用，但是當(dāng)它形成富集狀態(tài)之后，便會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性和血管內(nèi)皮毒性，能夠誘導(dǎo)OS。近年研究發(fā)現(xiàn)，Aβ的毒性作用與自由基有關(guān)，OS參與了Aβ致神經(jīng)毒性的調(diào)節(jié)〔8〕。

Aβ神經(jīng)毒性可以造成細(xì)胞膜損傷。Aβ誘導(dǎo) OS，產(chǎn)生ROS，引起細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的過(guò)氧化，產(chǎn)生過(guò)氧化物質(zhì)，如丙二醛等。這些過(guò)氧化脂質(zhì)體能夠進(jìn)一步破壞膜蛋白的功能。最直接反應(yīng)在過(guò)氧化脂質(zhì)體能夠改變細(xì)胞膜上磷脂的結(jié)構(gòu)，從而改變了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。

2.2 tau蛋白的氧化磷酸化與OS效應(yīng) NFTS是AD最主要的病理特征之一，它主要是由tau蛋白氧化磷酸化所形成〔9〕。tau蛋白是一種微管組織相關(guān)蛋白，它與微管結(jié)合的能力會(huì)由于高度磷酸化而消失，從而形成神經(jīng)纖維纏結(jié)導(dǎo)致神經(jīng)元功能的喪失。而OS與tau的高度磷酸化有密切聯(lián)系。ROS能夠使鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，鈣離子大量?jī)?nèi)流使鈣離子依賴(lài)性蛋白激酶以及鈣調(diào)蛋白激酶過(guò)度活化，造成蛋白磷酸酶與蛋白激酶的比例失衡，從而促進(jìn)tau蛋白異常磷酸化〔10〕。此外，ROS也可以通過(guò)抑制能量代謝使糖原合成激酶-3(GSK-3)代償性激活，而tau蛋白激酶(TPK)是GSK-3的異構(gòu)體，從而也促進(jìn)了tau蛋白的磷酸化〔11〕。

3 OS狀態(tài)的表征

在生理?xiàng)l件下，ROS主要來(lái)源于線(xiàn)粒體內(nèi)的氧化磷酸化〔12〕。自由基的產(chǎn)生會(huì)對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)，蛋白，DNA等生物大分子造成氧化損傷，因此生物體內(nèi)OS代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，對(duì)于OS狀態(tài)的表征具有極大的意義。

機(jī)體代謝過(guò)程中，ROS不斷通過(guò)非酶促反應(yīng)和酶促反應(yīng)產(chǎn)生，但在抗氧化酶以及外源性和內(nèi)源性抗氧化劑的協(xié)同作用下被不斷清除，自由基的產(chǎn)生與消除處于動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，可以維持在一個(gè)正常的水平之下。細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡是受到嚴(yán)格控制的，即便在老年癡呆癥的病態(tài)環(huán)境下，面臨ROS可能造成的損傷，細(xì)胞會(huì)發(fā)生相應(yīng)的抗氧化反應(yīng)，這些抗氧化因素的顯著改變也可以作為 OS發(fā)生的標(biāo)志〔13，14〕。

3.1 脂質(zhì)過(guò)氧化物 生物膜脂質(zhì)的磷脂中含有大量多不飽和脂肪酸(PUFA)，在ROS的作用下，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)，同時(shí)在脂質(zhì)反應(yīng)中產(chǎn)生的LOO·也會(huì)引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)〔15〕，從而產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，在AD病人腦內(nèi)，特別是NFTS中發(fā)現(xiàn)大量的OS產(chǎn)物丙二醛(MDA)等〔16〕。丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化物的裂解產(chǎn)物，其毒性較大，與衰老密切相關(guān)。MDA的生成量與脂質(zhì)過(guò)氧化程度相關(guān)，故可作為一個(gè)檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)。AD患者腦內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化物如，4-羥基壬烯酸(4-HNE)，丙醛等。盡管脂質(zhì)過(guò)氧化物可以通過(guò)檢測(cè)MDA含量定量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)中一般使用TBARS法，但是由于該方法不具有特異性，所以得到的結(jié)果并不準(zhǔn)確。相比之下，4-HNE比MDA更能反映AD患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)，可以通過(guò)HPLC或者GC/MS測(cè)定〔17〕。

但是對(duì)于脂質(zhì)過(guò)氧化物的檢測(cè)，多數(shù)通過(guò)解剖取得相關(guān)腦組織再進(jìn)行試驗(yàn)，因此如果能找到活體檢測(cè)方法表征氧化應(yīng)激的狀態(tài)就更理想了。磷脂分子中的PUFA氧化形成的過(guò)氧化物可以被水解成 F2-和 D2/E2-isoprostanes(IP)。Morrow等〔18〕人的研究發(fā)現(xiàn)AD病人腦脊液和腦室液中F2-IsoP水平顯著高于正常人。大量實(shí)驗(yàn)證明測(cè)量IP的含量對(duì)于活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化水平有很好的應(yīng)用前景。

3.2 蛋白氧化產(chǎn)物 細(xì)胞內(nèi)外富含大量蛋白質(zhì)，極易受到活性氧的攻擊使蛋白質(zhì)發(fā)生變化。ROS能夠氧化氨基酸殘基側(cè)鏈生成酮類(lèi)或醛類(lèi)衍生物。一些氨基酸諸如組氨酸，精氨酸，賴(lài)氨酸等很容易被氧化產(chǎn)生蛋白羰基衍生物〔19〕。Moreira等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，羰基是蛋白氧化產(chǎn)物，AD患者腦內(nèi)也出現(xiàn)蛋白羰基水平增高。蛋白羰基衍生物具有較高的穩(wěn)定性，且在氧化應(yīng)激過(guò)程中形成很早，故可以通過(guò)測(cè)定羰基的含量作為判斷蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)。大多數(shù)檢測(cè)蛋白羰基衍生物的方法都是基于羰基鏈與DNPH反應(yīng)，再通過(guò)特定的DNP抗體進(jìn)行檢測(cè)〔21〕。

EPR電磁自旋共振法(也可以稱(chēng)作ESR)也可以用于蛋白氧化的檢測(cè)。其原理是 2，2，6，6-tetramethyl-4-maleimido-piperidine-1-oxyl(MAL-6)〔22〕能夠與半胱氨酸的-SH基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成特異性的EPR光譜，用以評(píng)價(jià)結(jié)構(gòu)信息。EPR光譜能夠反映至少M(fèi)AL-6與膜蛋白結(jié)合的兩個(gè)位點(diǎn)，分為較強(qiáng)S和較弱W。構(gòu)象的改變或蛋白間作用力的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致W/S比例變小?！H通過(guò)Fenton反應(yīng)與膜蛋白作用也會(huì)導(dǎo)致W/S比例的下降，表明蛋白之間作用力增強(qiáng)〔23〕，從而表征蛋白氧化程度。趙保路〔24〕利用ESR方法，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層中活性氧含量升高。

3.3 DNA氧化產(chǎn)物 自由基能夠引起自由基損傷，其中最主要是·OH，它能夠攻擊脫氧核糖，使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA單鏈或者雙鏈斷裂，可以通過(guò)堿性洗脫法測(cè)定。此外，自由基還會(huì)導(dǎo)致DNA蛋白交聯(lián)，亦或是產(chǎn)生堿基修飾物，例如脫氧鳥(niǎo)苷被氧化產(chǎn)生堿基修飾物8-脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)。8-OHdG是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物，已經(jīng)被公認(rèn)為最能夠反應(yīng)機(jī)體DNA氧化損傷的理想生物指標(biāo)，在氧化應(yīng)激領(lǐng)域內(nèi)被廣泛采用。8-OHdG的形成可誘導(dǎo)損傷位點(diǎn)及鄰近堿基非特異性配對(duì)和錯(cuò)讀，其中以 GC-TA置換為主〔25〕，其含量可以通過(guò)HPLC或者GC/MS方法測(cè)定。

畢勝等〔26〕人的研究中用HPLC測(cè)量8-OHdG含量，發(fā)現(xiàn)AD病人的淋巴細(xì)胞內(nèi)8-OHdG基礎(chǔ)含量顯著高于對(duì)照組。朱紅敏等〔27〕用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法測(cè)定AD患者和正常人血漿中8-OHdG的水平，發(fā)現(xiàn)AD病人血漿中8-OHdG水平較正常組增高。

3.4 抗氧化物質(zhì) 機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度具有密切聯(lián)系，該防御體系有酶促與非酶促兩個(gè)體系，許多酶是以微量元素為活性中心，例如:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等，非酶促反應(yīng)體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質(zhì)。例如:VE、胡蘿卜素、VC、半胱氨酸、色氨酸、銅蘭蛋白、乳鐵蛋白等。Grundman〔28〕的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大量維生素E能夠延緩腦功能障礙的產(chǎn)生。這個(gè)體系的防護(hù)氧化作用主要通過(guò)三條途徑:①消除自由基和活性氧以免引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化;②分解過(guò)氧化物，阻斷過(guò)氧化鏈;③出去起催化作用的金屬離子。防御體系各成分之間相互起到了協(xié)同作用，以及代償作用與依賴(lài)作用。

單獨(dú)測(cè)定某一種或者某些抗氧化成分的含量往往不能全面反映組織的抗氧化能力，且有時(shí)在操作上難度較高，也較為繁瑣，因此可以測(cè)量組織中總抗氧化能力來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體總體上的抗氧化活性，這比測(cè)量已知的每一種抗氧化劑或者某個(gè)自由基含量更為有效和有說(shuō)服力〔15〕。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著世界人口老齡化，AD在老年人的疾病譜中已占據(jù)十分突出的位置，并成為嚴(yán)重威脅老年人健康的四大疾病之一。我國(guó)人口老化速度居世界各國(guó)之首，AD發(fā)病率呈現(xiàn)上升勢(shì)頭，流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)每年有近百萬(wàn)新發(fā)病例，AD已成為困擾老年人生活質(zhì)量、給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的常見(jiàn)疾病。許多證據(jù)表明OS與AD具有密切關(guān)系，但現(xiàn)在尚不完全清除究竟OS是AD的發(fā)病原因還是產(chǎn)生疾病之后的結(jié)果，OS是否是AD中最關(guān)鍵的原因仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。由于自由基很不穩(wěn)定，因此尋找敏感、具有特異性、操作簡(jiǎn)便的方法以及建立完善的評(píng)價(jià)體系對(duì)檢測(cè)生物體內(nèi)的自由基水平非常迫切。對(duì)于患有AD的患者來(lái)說(shuō)，不斷嘗試通過(guò)減少OS進(jìn)行治療應(yīng)該是可行的〔29〕。相信對(duì)AD的深入研究有助于人們更清楚了解該機(jī)病的發(fā)病機(jī)制，從而找出更有效的治療方法。

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