潘幀婕，曹 靖，李 鳴，任秀花，王劍南，邵金平，臧衛(wèi)東

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 鄭州 450001

電壓門控鈉離子通道1.7的α亞單位(Nav1.7α)由SCN9A基因所編碼(定位于染色體2q24.3)，包括26個外顯子，其主要表達(dá)在背根脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[1]。SCN9A基因的突變與3種先天性疾病有關(guān)：原發(fā)性紅斑肢痛癥、陣發(fā)性劇痛癥和先天性無痛癥[2-3]，說明Nav1.7α可能在疼痛的發(fā)生發(fā)展過程起重要作用。該實(shí)驗(yàn)利用谷氨酸鈉刺激PC12細(xì)胞模擬疼痛刺激，觀察Nav1.7表達(dá)量的變化，以判斷在細(xì)胞水平Nav1.7的表達(dá)量與疼痛刺激的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器谷氨酸鈉(美國Amresco公司，產(chǎn)品批號CAS#987-65-5)，DMEM(北京Solarbio公司)，胰蛋白酶、滅活胎牛血清(中國四季青公司)，Nav1.7兔抗鼠多克隆抗體(美國Abcam公司)；激光共聚焦顯微鏡(日本蔡司公司)，PCR儀(德國Biometra公司)，低溫離心機(jī)(德國Heraeus公司)，普通離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室提供，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，其中含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清、100 kU/L青霉素及100 μg/L鏈霉素。細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長至70%～80%融合后，2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為對照組和不同濃度的谷氨酸鈉刺激組。①對照組：用正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞。②不同濃度的谷氨酸鈉刺激組：在培養(yǎng)液中分別加入終濃度為5、10、20、40 nmol/L的谷氨酸鈉，與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)14 h。對照組與谷氨酸鈉刺激組培養(yǎng)條件一致。

1.4不同濃度谷氨酸鈉刺激后PC12細(xì)胞Nav1.7表達(dá)的免疫熒光檢測PC12細(xì)胞分別用0、5、20、40 nmol/L谷氨酸鈉培養(yǎng)14 h后用PBS沖洗3遍，采用40 g/L多聚甲醛固定30 min，用PBS沖洗5遍。經(jīng)體積分?jǐn)?shù)0.4% Triton 37 ℃通透10 min, PBS沖洗5遍。底物用含體積分?jǐn)?shù)3% H2O237 ℃孵育10 min, PBS沖洗5遍。山羊血清37 ℃孵育30 min。用Nav1.7單克隆抗體( 150稀釋)孵育4 h，PBS沖洗5遍。用綠色熒光二抗37 ℃孵育1 h，然后4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗5遍。用Depi(1100稀釋)復(fù)染細(xì)胞核，3 min，用PBS沖洗5遍，-20 ℃保存，共聚焦顯微鏡拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次結(jié)果選取10個細(xì)胞測定綠色熒光強(qiáng)度，結(jié)果取平均值。

1.5不同濃度谷氨酸鈉刺激后PC12細(xì)胞SCN9AmRNA表達(dá)水平的RT-PCR檢測PC12細(xì)胞分別用0、5、10、20、40 nmol/L谷氨酸鈉培養(yǎng)14 h后，行SCN9A mRNA表達(dá)水平的RT-PCR檢測。引物見表1。①細(xì)胞總RNA的提?。?收集各組細(xì)胞，加入1 mL Trizol，室溫放置5 min，使細(xì)胞充分裂解。再用氯仿、異丙醇、乙醇等處理，提取總RNA。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：RNA 10 μL，Random 1 μL，5×反應(yīng)緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，10 mol/L dNTP Mix 2 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL。42 ℃ 60 min，最后70 ℃ 5 min，終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。③PCR擴(kuò)增：反應(yīng)總體系為20 μL。cDNA 2 μL，2×Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DEPC水7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，33個循環(huán)；最后72 ℃ 8 min。④PCR產(chǎn)物分析：10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Glyko Bandscan軟件分析。以SCN9A與內(nèi)參照擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值的比值表示SCN9A mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-PCR的引物

1.6不同濃度谷氨酸鈉刺激后PC12細(xì)胞Nav1.7表達(dá)的Western-blot檢測PC12細(xì)胞分別用0、5、10、20 nmol/L的谷氨酸鈉培養(yǎng)14 h后，換成正常DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。常規(guī)胰蛋白酶消化后將胰蛋白酶吸出，加入培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打起來，收集細(xì)胞于EP管中，4 000 r/min離心5 min。用PBS洗3次，4 000 r/min離心5 min，棄上清加入細(xì)胞裂解液PMSF 500 μL，冰上孵育5～10 min，14 000 r/min離心 5 min，收集上清，100 ℃ 5 min。Bradford法測蛋白濃度。等量上樣后80 g/L分離膠電泳，110 V 90 min轉(zhuǎn)PVDF膜，體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶封閉2 h,洗滌后加Nav1.7一抗(1400稀釋)，4 ℃過夜，TBST洗滌3遍后加二抗(11 000稀釋)室溫2 h,增強(qiáng)型發(fā)光劑ECL顯色，曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取目的條帶與β-actin條帶光密度的比值。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用Graphpad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組PC12細(xì)胞免疫熒光、RT-PCR、Western-blot結(jié)果的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組PC12細(xì)胞Nav1.7表達(dá)的免疫熒光檢測結(jié)果見圖1和表2。

圖1 各組PC12細(xì)胞Nav1.7的免疫熒光染色結(jié)果(×200)

表2 各組PC12細(xì)胞Nav1.7免疫熒光檢測結(jié)果

F=61.871,P<0.001；*:與對照組比較，P<0.05。

2.2各組PC12細(xì)胞SCN9AmRNA的表達(dá)水平

見圖2和表3。

2.3各組PC12細(xì)胞Nav1.7表達(dá)的Western-blot檢測結(jié)果見圖3和表4。

圖2 各組PC12細(xì)胞SCN9A mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果

表3 各組PC12細(xì)胞SCN9A mRNA表達(dá)水平比較

F=11.821,P<0.001；*:與對照組比較，P<0.05。

圖3 各組PC12細(xì)胞Nav1.7的Western-blot檢測結(jié)果

表4 各組PC12細(xì)胞Western-blot檢測結(jié)果

F=23.274,P<0.001；*:與對照組比較，P<0.05。

3 討論

SCN9A表達(dá)于外周神經(jīng)元及交感神經(jīng)節(jié)，其單基因變異可導(dǎo)致3種與疼痛相關(guān)的遺傳性疾病。因此SCN9A有可能是研究疼痛的一把關(guān)鍵鑰匙[4]。有學(xué)者[5]觀察到Nav1.7與炎性痛的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而與神經(jīng)病理性疼痛無關(guān)。參與慢性疼痛形成與發(fā)展的神經(jīng)遞質(zhì)有許多，其中興奮性氨基酸[主要是谷氨酸(Glu)]是介導(dǎo)痛覺信息傳遞最主要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，以Glu為媒介的神經(jīng)沖動傳遞誘發(fā)痛覺中樞產(chǎn)生高度興奮性是慢性疼痛形成的重要基礎(chǔ)[6]。Glu可以引起神經(jīng)元興奮閾值降低、興奮性增高是慢性疼痛形成的重要起始因素。因此作者利用谷氨酸鈉刺激PC12細(xì)胞模擬疼痛刺激觀察細(xì)胞水平Nav1.7表達(dá)量的變化與疼痛刺激的關(guān)系。

PC12 細(xì)胞屬大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系。通常它們在含血清的培養(yǎng)基中可增殖，在加入神經(jīng)生長因子后細(xì)胞分化為交感神經(jīng)元的形態(tài)[7]，因此用PC12代替神經(jīng)節(jié)細(xì)胞研究Nav1.7的功能及在疼痛中的作用。

該實(shí)驗(yàn)以PC12高分化細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料。用不同濃度谷氨酸鈉刺激細(xì)胞，建立細(xì)胞水平上的疼痛模型。作者用免疫熒光和RT-PCR的方法，檢測不同濃度谷氨酸鈉刺激后PC12細(xì)胞SCN9A基因和Nav1.7蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果表明隨著疼痛刺激強(qiáng)度的增加，Nav1.7的表達(dá)也隨之增加。而谷氨酸鈉與炎性痛、神經(jīng)病理性痛均密切相關(guān)，提示Nav1.7在疼痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，該研究結(jié)果為疼痛的治療開辟了新的思路[8-10]。

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