田 婧，王雪晶，馬耀華，荊 婧，鄧文靜，蘇 楠，滕軍放

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)是一種造血營養(yǎng)因子。近些年研究[1]發(fā)現(xiàn)rhG-CSF在腦缺血中發(fā)揮保護(hù)作用。自噬是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)的形態(tài)學(xué)改變，并通過溶酶體介導(dǎo)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程，分為巨自噬、微自噬、分子伴侶介導(dǎo)自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)。CMA是組成型熱休克蛋白70(heat shock cognate protein 70, HSC-70)作為分子伴侶參與的細(xì)胞自我吞噬，對(duì)于機(jī)體保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義[2]。已有研究[3-4]顯示rhG-CSF可調(diào)控CMA。2006年Takemura等[3]發(fā)現(xiàn)rhG-CSF的心臟保護(hù)作用是通過對(duì)抗自噬性細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。2012年Jacquel等[4]發(fā)現(xiàn)CMA參與rhG-CSF介導(dǎo)的單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。作者觀察了rhG-CSF對(duì)缺氧人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞及缺血缺氧大鼠腦缺血周邊區(qū)組織CMA標(biāo)志性蛋白LAMP-2a及HSC-70表達(dá)的影響，探討rhG-CSF抑制缺血缺氧后神經(jīng)元損傷的機(jī)制，為rhG-CSF治療腦卒中提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.1.1 缺氧細(xì)胞模型的制備及處理 SH-SY5Y細(xì)胞由中南大學(xué)唐北沙教授饋贈(zèng)。將SH-SY5Y細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，換用預(yù)先以無氧混合氣體(VN2：VCO2=955)填充30 min的無糖DMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞立即置于無氧混合氣體填充的缺氧培養(yǎng)箱中，37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)6 h，制備成氧糖剝奪模型。然后將細(xì)胞接種在正常培養(yǎng)皿，分為3組，分別加入0、100、200 μg/L的rhG-CSF，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.1.2 細(xì)胞HSC-70、LAMP-2a蛋白測定 經(jīng)rhG-CSF孵育48 h后的細(xì)胞以裂解液裂解，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，采用二辛可寧酸法行蛋白質(zhì)定量檢測，然后提取總蛋白 25 μg，采用SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，加入一抗(抗人HSC-70抗體按1500稀釋、LAMP-2a抗體按1800稀釋、GAPDH抗體按15 000稀釋)，4 ℃過夜。次日加入過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，置于水平脫色搖床上孵育2 h，ECL光化學(xué)法顯色，暗室中行X線膠片曝光。使用凝膠分析系統(tǒng)分析，測定各條帶的光密度值，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH光密度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SD大鼠54只，體質(zhì)量280～320 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組，每組18只。假手術(shù)組僅進(jìn)行頸部手術(shù)，不栓塞大腦中動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)組及模型組均制備大腦中動(dòng)脈栓塞模型[5]。術(shù)后2 h實(shí)驗(yàn)組給予rhG-CSF(50 μg·kg-1·d-1)注射5 d，模型組和假手術(shù)組給予等量生理鹽水。各組大鼠使用300 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸，經(jīng)心尖至升主動(dòng)脈入路，依次用生理鹽水和40 g/L甲醛溶液各200 mL灌注，然后斷頭完整取腦。

1.2.2 大鼠腦缺血周邊區(qū)組織HSC-70、LAMP-2a蛋白測定 取0.1 g腦缺血周邊區(qū)組織，PBS漂洗3次，加入裂解液后勻漿，然后轉(zhuǎn)入EP管中超聲，離心后收集上清。用考馬斯亮藍(lán)法測量蛋白濃度，采用Western blot法檢測HSC-70和LAMP-2a，操作同1.1.2。

1.2.3 大鼠腦缺血周邊區(qū)組織MAP-2蛋白檢測 取腦缺血周邊區(qū)組織，切片脫水、石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水后，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，50 g/L小牛血清封閉，室溫孵育30 min，滴加1200稀釋的MAP-2多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，滴加HRP標(biāo)記的二抗，PBS漂洗后，DAB顯色，常規(guī)脫水透明，樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 模型建立后在動(dòng)物蘇醒后即刻及術(shù)后第7天，由不了解動(dòng)物分組的人員參照改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分方法對(duì)3組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，總分18分，分值越高，損傷越嚴(yán)重。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組細(xì)胞HSC-70、LAMP-2a蛋白的表達(dá)及3組大鼠HSC-70、LAMP-2a蛋白的表達(dá)，采用LSD-t檢驗(yàn)行組間兩兩比較；采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較模型組和實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分的差值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞HSC-70、LAMP-2a蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖1、表1。

圖1 不同質(zhì)量濃度rhG-CSF對(duì)細(xì)胞HSC-70、LAMP-2a蛋白表達(dá)水平的影響

表1 不同質(zhì)量濃度rhG-CSF對(duì)細(xì)胞HSC-70、LAMP-2a蛋白表達(dá)水平的影響

*：與0 μg/L組比較，P<0.05；#：與100 μg/L組比較，P<0.05。

2.2 3組大鼠腦缺血周邊區(qū)組織HSC-70、LAMP-2a蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖2、表2。

2.3 3組大鼠腦缺血周邊區(qū)組織MAP-2蛋白的表達(dá)與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組可見密集、粗大、呈叢狀的MAP-2免疫反應(yīng)陽性的樹突，見圖3。

圖2 大鼠腦缺血周邊區(qū)組織HSC-70、LAMP-2a 蛋白的表達(dá)

表2 3組大鼠腦組織中HSC-70、LAMP-2a 蛋白的表達(dá)水平

*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。

圖3 MAP-2免疫組化染色結(jié)果(SP，×400)

2.4 3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià)假手術(shù)組術(shù)后蘇醒時(shí)及術(shù)后第7天神經(jīng)功能正常，神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0。模型組與實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較見表3。

表3 模型組與實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分

*：t=6.322,P<0.001。

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn)，rhG-CSF可以動(dòng)員骨髓干細(xì)胞向腦梗死部位遷移，并向神經(jīng)細(xì)胞分化，替代受損傷的神經(jīng)細(xì)胞，同時(shí)通過促進(jìn)病變腦組織的血管生成，改善局部血流量，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌及抑制炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[6]。作者觀察rhG-CSF對(duì)缺氧SH-SY5Y細(xì)胞及缺血缺氧大鼠腦缺血周邊區(qū)組織CMA標(biāo)志性蛋白LAMP-2a及HSC-70表達(dá)的影響，探討rhG-CSF抑制缺血缺氧后神經(jīng)元損傷的機(jī)制。

HSC-70為熱休克蛋白70家族成員之一。LAMP-2a為表達(dá)在溶酶體膜上的單次跨膜蛋白。CMA的過程是當(dāng)細(xì)胞受到氧化性損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白暴露出KFERQ序列，被作為分子伴侶的HSC-70識(shí)別結(jié)合，形成分子伴侶-底物復(fù)合物，然后引導(dǎo)該復(fù)合物到達(dá)溶酶體并與溶酶體膜上的LAMP-2a結(jié)合，將損傷的蛋白質(zhì)等運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)降解[7-8]。

該研究證實(shí)，在細(xì)胞及動(dòng)物模型水平rhG-CSF均可上調(diào)HSC-70與LAMP-2a的表達(dá)，說明rhG-CSF提高了缺氧細(xì)胞及缺血缺氧后大鼠腦組織CMA的水平，但rhG-CSF上調(diào)CMA的機(jī)制尚不明確。在巨自噬的研究[9]中已證實(shí)在腦出血中，NF-κb特異性抑制劑SN50通過抑制NF-κb信號(hào)通路在一定程度上促進(jìn)了腦出血后巨自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)。rhG-CSF可抑制NF-κb，那么rhG-CSF是否通過抑制NF-κb而上調(diào)CMA的活性有待進(jìn)一步研究。

該研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分在證實(shí)rhG-CSF上調(diào)缺血缺氧后腦組織CMA活性的同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)使用rhG-CSF后神經(jīng)元內(nèi)MAP-2表達(dá)增加，神經(jīng)功能得到改善。MAP-2為存在于樹突中的神經(jīng)元標(biāo)志性骨架蛋白，可反映神經(jīng)元代償修復(fù)及神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元的狀況。因此rhG-CSF可能通過上調(diào)CMA在腦缺血中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。原因考慮如下：首先，CMA上調(diào)可選擇性地清除由某些病毒、病原體及錯(cuò)誤折疊而形成的凝聚蛋白或受損的細(xì)胞器，有利于神經(jīng)功能恢復(fù)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[10]。其次，上調(diào)自噬可促進(jìn)細(xì)胞分化。在低等生物中，自噬可參與酵母孢子的形成和分化[11]。在血液系統(tǒng)中，自噬可參與單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[12]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，自噬上調(diào)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，所以自噬的上調(diào)可以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[9]。rhG-CSF動(dòng)員到達(dá)腦缺血區(qū)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，可能與其上調(diào)CMA促進(jìn)細(xì)胞分化有關(guān)?？傊?，CMA的上調(diào)可能從多個(gè)途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。

綜上所述，該研究通過動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)在缺血缺氧損傷中，rhG-CSF能上調(diào)CMA。腦缺血中rhG-CSF可能通過上調(diào)CMA發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，這為rhG-CSF的臨床應(yīng)用提供了更多的理論依據(jù)。

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