李文杰，王明洋，白銀亮，程月芳，李 靜，劉 宇，張 旗#

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)系 鄭州 450001 2)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科 蘭州 730030 3)河南省腫瘤醫(yī)院藥劑科 鄭州 450008

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracelluar signal-regulated kinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一員，有研究[1]表明ERK(尤其是ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與嗎啡依賴戒斷過程。多種細(xì)胞模型被用于研究嗎啡依賴和戒斷過程中ERK1/2磷酸化的表達(dá)情況，但研究結(jié)果并不一致，甚至相反；作者還發(fā)現(xiàn)不同研究者建立細(xì)胞嗎啡依賴與戒斷模型中所用的血清濃度和納洛酮濃度等實(shí)驗(yàn)條件并不相同[2-5]。而血清作為體外細(xì)胞培養(yǎng)必需的一種天然培養(yǎng)基，成分復(fù)雜，其中含有的大量促生長的成分如生長因子、激素、貼壁因子等對MAPKs家族激酶活性的影響較大[6-7]，所以作者推測血清對研究嗎啡依賴與戒斷過程中ERK的磷酸化水平會有明顯影響。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)來源于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-SH)株[8]，表達(dá)μ、δ阿片受體[9]，已廣泛用于建立細(xì)胞嗎啡依賴和戒斷模型。該實(shí)驗(yàn)擬建立SH-SY5Y嗎啡依賴戒斷模型，探討血清濃度和納洛酮濃度對ERK1/2、p38和JNK蛋白磷酸化表達(dá)的影響，以期確證影響ERK磷酸化表達(dá)的關(guān)鍵因素，為今后研究嗎啡依賴及戒斷機(jī)制提供適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

1 材料與方法

1.1試劑及儀器DMEM/F12(11)培養(yǎng)基和青、鏈霉素均購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司(批號N×L0742)；胎牛血清(FBS)購自上海依科賽生物制品有限公司(批號120502)；抗β-actin抗體 (兔抗人)、抗p-ERK1/2、p-p38和p-JNK抗體(兔抗人)購自Cell Signalling Technology公司；蛋白酶抑制劑(Cat.No.04 693 116 001)、磷酸酶抑制劑(Cat. No.04 906 845 001 )均購自Roche公司；鹽酸納洛酮注射液(貴州聯(lián)合西創(chuàng)藥物有限公司，批號20110601)；鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號110111-2)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CJ-2F超凈工作臺(蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，Z-323型高速冷凍離心機(jī)(德國HERMLE公司)。

1.2細(xì)胞來源、培養(yǎng)及分組SH-SY5Y細(xì)胞由北京宣武醫(yī)院惠贈，在含有體積分?jǐn)?shù)10%的FBS、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12(11)培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇、傳代按照常規(guī)方法進(jìn)行。取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，以(1～3)×105個(gè)/孔接種于6孔板中，分別設(shè)無血清培養(yǎng)組和有血清培養(yǎng)組。待細(xì)胞生長達(dá)80%～90%融合時(shí)，無血清培養(yǎng)組以不含血清的DMEM/F12(11)培養(yǎng)基作用10 h后，加入10 μmol/L的嗎啡孵育48 h后，戒斷組給予10 μmol/L的納洛酮戒斷10、30和60 min，空白對照組不經(jīng)嗎啡處理，嗎啡組用嗎啡孵育48 h后不經(jīng)納洛酮處理；或者用10 μmol/L的嗎啡孵育48 h后，戒斷組以5、10和30 μmol/L納洛酮戒斷10 min。有血清培養(yǎng)組與上述培養(yǎng)過程完全一致，僅在培養(yǎng)過程中加入體積分?jǐn)?shù)10%FBS。

1.3p-ERK1/2、p-p38和p-JNK蛋白表達(dá)的Westernblot檢測棄去6孔板中的培養(yǎng)液，冰浴的PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液 (每孔加入100 μL RIPA裂解緩沖液、4 μL 蛋白酶抑制劑、10 μL磷酸酶抑制劑) 冰上裂解30 min。然后，利用冷凍離心機(jī)4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清。采用BCA法測定樣品中總蛋白質(zhì)的含量，調(diào)整上樣量為30～40 μg。利用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入一抗(兔抗人p-ERK1/2、p-p38和p-JNK抗體均按11 000稀釋) 4 ℃過夜。TBST漂洗3次，10 min/次，加入二抗(按110 000稀釋，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體)室溫孵育2 h。再次以TBST漂洗3次，10 min/次，ECL顯色，利用軟件Image pro plus 6.0比較條帶的積分光密度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)比較各組光密度值的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1有和無血清培養(yǎng)對10μmol/L納洛酮戒斷不同時(shí)間后SH-SY5Y細(xì)胞中p-ERK1/2表達(dá)的影響見圖1和表1。

圖1 有(上)和無(下)血清培養(yǎng)對10 μmol/L納洛酮戒斷不同時(shí)間SH-SY5Y細(xì)胞中p-ERK1/2表達(dá)的影響

表1 有和無血清培養(yǎng)對10 μmol/L納洛酮戒斷不同時(shí)間SH-SY5Y細(xì)胞中p-ERK1/2表達(dá)的影響

*:與嗎啡組比較，P<0.05。

2.2有和無血清培養(yǎng)對不同濃度納洛酮戒斷SH-SY5Y細(xì)胞中p-ERK1/2表達(dá)的影響見表2。

表2 有和無血清培養(yǎng)對不同濃度納洛酮戒斷SH-SY5Y細(xì)胞中p-ERK1/2表達(dá)的影響

*:與嗎啡組比較，P<0.05。

2.3有和無血清培養(yǎng)對10μmol/L納洛酮戒斷不同時(shí)間SH-SY5Y細(xì)胞中p-p38、p-JNK表達(dá)水平的影響見圖2，表3、4。

圖2 有和無血清培養(yǎng)對10 μmol/L納洛酮戒斷不同時(shí)間SH-SY5Y細(xì)胞中p-p38(上)、p-JNK(下)表達(dá)水平的影響

表3 有和無血清培養(yǎng)對10 μmol/L納洛酮戒斷不同時(shí)間SH-SY5Y細(xì)胞中p-p38表達(dá)的影響

*：與嗎啡組比較，P<0.05；△：戒斷組間兩兩比較，P<0.05。

表4 有和無血清培養(yǎng)對10 μmol/L納洛酮戒斷SH-SY5Y細(xì)胞中p-JNK表達(dá)的影響

*：與嗎啡組比較，P<0.05；△：戒斷組間兩兩比較，P>0.05。

3 討論

該實(shí)驗(yàn)成功建立了SH-SY5Y細(xì)胞嗎啡依賴戒斷模型。結(jié)果顯示納洛酮戒斷能誘發(fā)無血清培養(yǎng)組細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平的瞬時(shí)升高，戒斷后10 min時(shí)達(dá)峰值，接著迅速恢復(fù)至基值水平；而有血清培養(yǎng)組細(xì)胞則表現(xiàn)出ERK1/2磷酸化水平的持續(xù)升高，從戒斷后10 min一直持續(xù)到60 min。在無和有血清培養(yǎng)條件下，納洛酮戒斷均引起p38磷酸化水平時(shí)間依賴性遞增，也能引起JNK磷酸化水平的增加，但戒斷不同時(shí)間點(diǎn)之間JNK磷酸化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Burgess等[10]研究表明血清能劑量依賴性地上調(diào)ERK1/2的磷酸化水平。Lee等[7]也發(fā)現(xiàn)FBS能在短時(shí)間內(nèi)(2 min)上調(diào)ERK1/2的磷酸化水平，并導(dǎo)致p-ERK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至胞核，而MEK特異抑制劑U0126能夠顯著抑制FBS引起的ERK1/2蛋白磷酸化。作者的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，體積分?jǐn)?shù)為10% FBS確實(shí)能明顯增加p-ERK1/2、p-JNK和p-p38的水平。

關(guān)于ERK參與嗎啡成癮及戒斷過程的報(bào)道很多，但作者發(fā)現(xiàn)在動物模型中針對嗎啡調(diào)節(jié)ERK磷酸化研究在不同對象中研究結(jié)果并不一致，甚至在同一對象不同腦區(qū)的研究結(jié)果也不一致[1,11]。這就表明嗎啡與ERK的作用是一復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。但較為一致的是，納洛酮戒斷后均表現(xiàn)出ERK的磷酸化水平急劇升高。在細(xì)胞模型中，也有各種不同的結(jié)果[12-14]。近年來的研究[3]結(jié)果顯示，體積分?jǐn)?shù)0.5%FBS條件下培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，1 μmol/L嗎啡作用72 h能引起ERK1/2磷酸化水平降低，3 μmol/L納洛酮戒斷10 min后進(jìn)一步降低，但隨著時(shí)間延長，又逐漸恢復(fù)升高。有學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)10%FBS條件下培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，1 μmol/L芬太尼作用60 min內(nèi)ERKs磷酸化水平?jīng)]有明顯變化，慢性作用7 d沒有明顯變化，10 μmol/L納洛酮戒斷也沒有明顯變化。 Ferrer-Alcon等[5]也發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)10%FBS條件下培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，1 μmol/L嗎啡作用1～60 min，3 min后就能檢測到ERK磷酸化水平的明顯升高，30 min達(dá)峰值，60 min時(shí)則恢復(fù)至基值水平。作者在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)血清對細(xì)胞嗎啡依賴模型中ERK1/2磷酸化表達(dá)時(shí)程有明顯影響，血清能明顯延長ERK1/2磷酸化高表達(dá)持續(xù)時(shí)間。作者還發(fā)現(xiàn)5～30 μmol/L的納洛酮對ERK1/2磷酸化表達(dá)時(shí)程并無明顯影響。由此作者推測，影響SH-SY5Y細(xì)胞嗎啡依賴戒斷模型中ERK1/2磷酸化表達(dá)的主要影響因素為血清。

JNK、p38MAPK通路是與ERK1/2并行的MAPKs信號通路。研究[15]表明，哺乳類細(xì)胞可以通過多種機(jī)制維持其每一條MAPKs信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性。即使在細(xì)胞凋亡過程中ERK1/2與JNK、p38也表現(xiàn)出相反的作用[16-17]。研究[13]顯示，納洛酮催促嗎啡戒斷能誘導(dǎo)多個(gè)區(qū)域ERK1/2磷酸化的高表達(dá)，但對JNK和p38磷酸化沒有明顯影響。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納洛酮能誘發(fā)ERK1/2、JNK和p38蛋白磷酸化水平高表達(dá)，但對其表達(dá)時(shí)程的影響并不一致，有血清培養(yǎng)能明顯延長p-ERK高表達(dá)持續(xù)時(shí)間，由此可見，血清因素對研究納洛酮嗎啡戒斷ERK1/2磷酸化表達(dá)有明顯影響，而不同濃度納洛酮戒斷對ERK1/2磷酸化水平?jīng)]有明顯影響，這就為進(jìn)一步在SH-SY5Y細(xì)胞中探索納洛酮戒斷機(jī)制提供了方法學(xué)依據(jù)。

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