王 婷，歐 敏，黃友章

中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院干部呼吸科 北京100048

大量研究[1-2]表明，低氧造成的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和平滑肌收縮是發(fā)生肺動(dòng)脈高壓的主導(dǎo)因素。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血管內(nèi)壁的屏障，而且分泌釋放多種生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管張力和平滑肌增殖，參與凝血?jiǎng)┛寡ㄐ纬桑绊懷芡ㄍ感院臀镔|(zhì)交換。其中，內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的最強(qiáng)的血管收縮因子，而內(nèi)皮源性舒張因子主要為一氧化氮(nitric oxide，NO)和花生四烯酸代謝產(chǎn)物前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)。益肺活血復(fù)方是董建華院士臨床治療肺心病的一組中藥復(fù)方，既往研究[3-4]表明，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上，益肺活血復(fù)方可抑制中膜增厚、減輕血管縮窄、降低肺動(dòng)脈高壓。臨床上低氧常伴有二氧化碳的增高，因此該實(shí)驗(yàn)采用體外低氧高二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)，研究益肺活血復(fù)方對(duì)HPAECs微結(jié)構(gòu)及分泌ET-1、NO及PGI2的影響，從而探討其在肺動(dòng)脈高壓治療中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與細(xì)胞雄性新西蘭大耳白兔20只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(2.00±0.02) kg[北京市房山區(qū)官道順利養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0004]，以標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境溫度保持在18～29 ℃。HPAECs購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。

1.2儀器及試劑低氧高二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液(美國(guó)M&G公司)，NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ET-1及PGI2放射免疫測(cè)定試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)。

1.3藥物益肺活血復(fù)方(黃芪100 g、潞黨參120 g、白術(shù)60 g、當(dāng)歸90 g、桃仁120 g、紅花90 g、牛膝80 g、川芎50 g、赤芍60 g、陳皮70 g、柴胡50 g、桔梗50 g、枳殼60 g、甘草30 g、生地黃90 g)加重蒸水1 500 mL，同時(shí)煎沸20 min,過(guò)濾2次后合并2次濾液，4 000 r/min離心15 min后取上清液，濃縮至含生藥0.001 g/L。

1.4含藥血清的制備20只新西蘭大耳白兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：空白對(duì)照組及低、中、高劑量益肺活血復(fù)方組，每組5只。每天2次分別以中藥低劑量(10 g/kg)、中劑量(20 g/kg)、高劑量(40 g/kg)灌胃，空白對(duì)照組以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)給藥2 h后腹主動(dòng)脈采血，離心后分離血清，合并同組含藥血清，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)HPAECs于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈多角形、鋪路石樣外觀；待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合后用胰蛋白酶消化傳代1次，方法參照美國(guó)ScienCell公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。選用3～5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將HPAECs細(xì)胞懸液接種到含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞70%融合后，分組并干預(yù)?？瞻讓?duì)照組：體積分?jǐn)?shù)21% O2、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下加入含體積分?jǐn)?shù)10%空白對(duì)照組血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；模型組：體積分?jǐn)?shù)5% O2、體積分?jǐn)?shù)8% CO2條件下加入含體積分?jǐn)?shù)10%空白對(duì)照組血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；低、中、高劑量益肺活血復(fù)方組：體積分?jǐn)?shù)5% O2、體積分?jǐn)?shù)8% CO2條件下加入含體積分?jǐn)?shù)10%低、中、高劑量益肺活血復(fù)方組含藥血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清或細(xì)胞用于檢測(cè)。

1.6細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察共同孵育12 h后，各組細(xì)胞經(jīng)PBS液漂洗3次后，用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛4 ℃固定1 h，然后用10 g/L鋨酸4 ℃固定120 min，再進(jìn)行梯度乙醇脫水、環(huán)氧丙烷置換及包埋，最后進(jìn)行連續(xù)超薄切片及電鏡觀察。

1.7細(xì)胞培養(yǎng)液上清ET-1及PGI2含量的測(cè)定共同孵育12 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)錅y(cè)。ET-1和PGI2測(cè)定均采用放射免疫法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。ET-1檢測(cè)靈敏度<0.005 pg/L，批內(nèi)變異<10%，批間變異<15%。PGI2檢測(cè)靈敏度<0.025 pg/L，批內(nèi)變異<3.5%,批間變異<10%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.8細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量的硝酸還原酶法測(cè)定

將生長(zhǎng)良好的HPAECs接種于12孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，按1.5分組加不同的含藥血清干預(yù)，12 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，按照NO測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。用721型分光光度計(jì)測(cè)定550 nm處的吸光度，并計(jì)算NO含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較5組細(xì)胞培養(yǎng)液或培養(yǎng)液上清中ET-1、NO及PGI2含量的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察與空白對(duì)照組相比，透射電鏡下模型組可見(jiàn)細(xì)胞損傷，細(xì)胞膜不完整，胞質(zhì)溶解，出現(xiàn)裸核，核周間隙擴(kuò)張，核膜內(nèi)外層之間分開(kāi)；線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，膜不完整。與模型組相比，低劑量益肺活血復(fù)方組細(xì)胞同樣呈現(xiàn)較重的細(xì)胞損傷，而中、高劑量益肺活血復(fù)方組細(xì)胞損傷較模型組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 透射電鏡下各組HPAECs微結(jié)構(gòu)的改變

2.2益肺活血復(fù)方含藥血清對(duì)HPAECs分泌ET-1、NO及PGI2的影響各組細(xì)胞處理12 h后，模型組ET-1含量高于空白對(duì)照組；而與模型組相比，中、高劑量益肺活血復(fù)方組ET-1含量減少。模型組NO和PGI2含量低于空白對(duì)照組；而與模型組相比，中、高劑量益肺活血復(fù)方組NO及PGI2含量增高。見(jiàn)表1。

表1 各組HPAECs細(xì)胞培養(yǎng)液或培養(yǎng)液上清中ET-1、NO及PGI2含量比較(n=6)

*:與空白對(duì)照組比較，P<0.01；#:與模型組比較，P<0.01。

3 討論

研究[5]表明，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅具有屏障功能，而且是許多血管活性物質(zhì)合成、代謝的主要場(chǎng)所。低氧使血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫，甚至凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞屏障功能受損；另一方面還導(dǎo)致內(nèi)源性肺血管舒張和收縮物質(zhì)分泌失衡。益肺活血復(fù)方是治療慢性肺心病的經(jīng)驗(yàn)方[3-4]。

低氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞水腫，失去正常排列，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹且嵴較模糊，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)巨大空泡；內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損大大降低了細(xì)胞屏障功能。ET-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，在維持機(jī)體血管緊張性方面發(fā)揮重要作用，能引起強(qiáng)烈的血管收縮，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致血管重塑和肺動(dòng)脈高壓的形成。研究[6]發(fā)現(xiàn)，低氧能引起培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因轉(zhuǎn)錄和肽合成的增加。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的內(nèi)皮源性舒張因子主要為NO和花生四烯酸代謝產(chǎn)物PGI2。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO可迅速擴(kuò)散進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)而松弛平滑肌[7]。NO還可以直接抑制血管平滑肌細(xì)胞增生，抑制血管重塑[8-9]。王慧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，低氧可導(dǎo)致大鼠肺血管內(nèi)皮功能障礙，NO生成減少；而PGI2由表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和平滑肌細(xì)胞核膜及質(zhì)膜上的前列環(huán)素合酶參與合成，具有較強(qiáng)的血管舒張和抗有絲分裂活性，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于臨床治療肺動(dòng)脈高壓。

該研究發(fā)現(xiàn)，低氧高二氧化碳造成HPAECs的細(xì)胞微結(jié)構(gòu)受損，且低氧下HPAECs分泌的ET-1明顯高于常氧組，NO和PGI2明顯低于常氧組。而中、高劑量的益肺活血復(fù)方含藥血清能減輕細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷程度，減少HPAECs分泌ET-1，促進(jìn)其分泌NO和PGI2。因此，作者推斷益肺活血復(fù)方可能通過(guò)減輕HPAECs結(jié)構(gòu)損傷的程度從而改善其內(nèi)分泌功能；或者益肺活血復(fù)方可直接影響內(nèi)皮細(xì)胞血管活性物質(zhì)生成的某個(gè)環(huán)節(jié)，并在肺動(dòng)脈高壓的治療中發(fā)揮一定的作用。但其調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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