駱梅青，卜 慶，曹軼林，鄭桂銀，伍愛華

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 桂林 541001

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居全球首位。目前最新理論[1]認(rèn)為腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，惡性腫瘤中存有數(shù)量極少的腫瘤干細(xì)胞，在腫瘤的形成和生長中起著決定性作用，這些腫瘤干細(xì)胞具有無限增殖、自我更新及分化的能力，并表達(dá)相似的分子標(biāo)記和基因產(chǎn)物。 Nanog在2003年由Chambers等[2]報道,為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，在維持細(xì)胞自我更新和保持全能性中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)腫瘤的增生、侵襲和轉(zhuǎn)移，目前在乳癌、肝癌、前列腺癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中都有報道[3-4]。作者通過免疫組化方法和實時熒光定量PCR方法檢測了NSCLC組織中Nanog的表達(dá)，并進(jìn)一步探討Nanog的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2005年1月至2007年3月手術(shù)切除或經(jīng)頸胸腔鏡活檢的NSCLC標(biāo)本106例，男81例，女25例?；颊吣挲g35～75歲,中位年齡50歲。106例中鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)57例,腺癌49例，均經(jīng)病理明確診斷。病理分級：Ⅰ級39例，Ⅱ級34例，Ⅲ級33例。T分期：T1～261例，T3～445例；N分期：N059例，N1～347例。另取10例正常肺組織標(biāo)本(為明確診斷而行CT下肺穿刺或纖支鏡檢查，病理診斷為正常肺組織)作對照。標(biāo)本一部分液氮保存，另一部分石蠟包埋切片。所有患者術(shù)前均未做化療、放療, 有完整的臨床和隨訪資料；隨訪至2012年9月，生存期為確診之日至死亡或末次隨訪時間。

1.2主要試劑鼠抗人Nanog單克隆抗體購自美國Cell Signal公司,SP法免疫組化試劑盒及DAB顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。Trizol購自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Ferments公司產(chǎn)品,SYBR Green PCR為 TaKaRa公司產(chǎn)品，實時熒光定量PCR儀為美國安捷倫公司產(chǎn)品。其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑均購自Sigma公司。

1.3NSCLC和正常肺組織中Nanog蛋白的檢測

實驗步驟嚴(yán)格按照免疫組化SP試劑盒說明進(jìn)行。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液室溫下孵育15 min，高壓抗原修復(fù)2 min后冷卻至室溫，滴加山羊血清,室溫下孵育10 min,棄血清,滴加一抗工作液(按1100稀釋),4 ℃冰箱過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗,37 ℃孵育10 min，DAB顯色，自來水反復(fù)沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水,二甲苯透明，中性樹膠封片。用 PBST代替一抗作陰性對照。SP染色陽性反應(yīng)物呈棕黃色。采用半定量積分法判定結(jié)果, 每張切片選5個高倍視野,計數(shù)100個細(xì)胞,陽性細(xì)胞百分比≤5%為0分,～25%為1分,～50%為2分,～75%為3分,>75%為4分;根據(jù)免疫陽性細(xì)胞染色程度,黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。兩項積分相乘,0～1分為陰性，≥2分為陽性[5]。

1.4NSCLC和正常肺組織中NanogmRNA的測定取10～15 mg液氮保存的組織標(biāo)本，Trizol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL，Nanog上游引物：5’-CAGAAGGCCTCAGCACCTAC-3’,下游引物：5’-ATTGTTCCAGGTCTGGTTGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為111 bp。內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’，下游引物5’-CCA GAGGCGTACAGGGATAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為152 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45個循環(huán)。實時熒光定量PCR儀自動生成Ct并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及融解曲線。所生成的Ct值取均值后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出目的基因的表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。采用確切概率法比較NSCLC和正常肺組織中Nanog蛋白陽性表達(dá)率的差異,χ2檢驗比較不同人口學(xué)特征和臨床病理特征的NSCLC患者Nanog蛋白陽性表達(dá)率的差異。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗進(jìn)行生存分析。采用單因素方差分析比較NSCLC和正常肺組織及不同病理級別的NSCLC組織中Nanog mRNA表達(dá)量的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同組織中Nanog蛋白的表達(dá)Nanog蛋白陽性染色為棕黃色顆粒, 主要分布于NSCLC細(xì)胞胞核中，見圖1。NSCLC組織中Nanog蛋白陽性表達(dá)率為24.5%(26/106)，而在正常組織中未見表達(dá)，2者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.114)。

圖1 正常肺組織(A)、肺鱗癌組織(B)和肺腺癌組織(C)中Nanog蛋白的表達(dá)(SP，×400)

2.2Nanog蛋白的表達(dá)與NSCLC患者一般人口學(xué)特征及臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表1。

2.3Nanog蛋白的表達(dá)與NSCLC預(yù)后的關(guān)系生存曲線見圖2、3。肺鱗癌患者中Nanog蛋白陰性表達(dá)者及陽性表達(dá)者的M(T25，T75) 分別為36(20，60)和32(16，36)個月，Nanog蛋白的表達(dá)與肺鱗癌患者的預(yù)后無關(guān)(χ2=0.013，P=0.917)，但肺腺癌患者中Nanog蛋白陰性表達(dá)者及陽性表達(dá)者的M(T25，T75) 分別為48(36，56)和33(14，57)個月，Nanog陰性表達(dá)者預(yù)后較好(χ2=5.352，P=0.020)。

表1 Nanog蛋白的表達(dá)與NSCLC患者一般人口學(xué)特征及臨床病理特征的關(guān)系

圖2 Nanog蛋白的表達(dá)與肺鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖3 Nanog蛋白的表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4不同組織中NanogmRNA的表達(dá)Nanog mRNA在正常肺組織中的表達(dá)量(0.277±0.190)明顯低于NSCLC組織(0.950±0.183)，2者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=122.662，P<0.001)；Nanog mRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級NSCLC組織中的表達(dá)量分別為(0.831±0.194)、(0.905±0.144)和(1.076±0.123)，3者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.047,P=0.020)。

3 討論

目前腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞由數(shù)量較少的腫瘤干細(xì)胞和大多數(shù)表型不同的腫瘤分化細(xì)胞組成[6]。腫瘤干細(xì)胞數(shù)量較少但難以清除的特點是導(dǎo)致腫瘤治療效果差、生存期短的主要原因[7]。Nanog基因是胚胎發(fā)育早期的轉(zhuǎn)錄因子之一，在胚胎發(fā)育過程中維持正常的組織分化和個體發(fā)育；Nanog基因也是體外誘導(dǎo)iPS的主要基因之一，為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。基于這種觀點，檢測調(diào)控腫瘤干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵基因Nanog的表達(dá)在腫瘤研究中具有重要意義[8]。目前研究[9]表明，Nanog除了能在生殖細(xì)胞系及生殖細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)外，在肺癌組織中也有表達(dá)。

該研究結(jié)果表明，Nanog蛋白在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率高于正常肺組織，提示Nanog蛋白的表達(dá)可能與NSCLC的發(fā)生有關(guān)。此外，Nanog蛋白的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類型有關(guān)，在腺癌中的表達(dá)明顯高于鱗癌，與文獻(xiàn)[10]的研究結(jié)果一致。同時，該研究結(jié)果還顯示，Nanog蛋白的陽性表達(dá)率隨著病理級別的增高有升高的趨勢，提示Nanog蛋白的表達(dá)可能與NSCLC的惡性程度有關(guān)。另有文獻(xiàn)[11]報道，在腎細(xì)胞癌中Nanog為抑癌因素，提示在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，即使是同一種基因也會發(fā)揮不同的作用。

該研究結(jié)果還顯示，與正常肺組織相比，Nanog mRNA在NSCLC組織中高表達(dá)，并且隨病理級別的增高有升高的趨勢。有些學(xué)者[12]認(rèn)為其原因可能為導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的發(fā)生，但闡明其具體機(jī)制還需相關(guān)實驗進(jìn)一步驗證。體外實驗[13-14]表明，干細(xì)胞標(biāo)記物會隨著干細(xì)胞分化程度的增高而減少，這與文獻(xiàn)[15]報道的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物與肺癌組織的不同分化程度有關(guān)相一致。

此外，該研究結(jié)果還顯示，Nanog蛋白的表達(dá)與肺鱗癌的預(yù)后無關(guān)，但與肺腺癌的預(yù)后有關(guān)，Nanog蛋白陰性表達(dá)者預(yù)后較好。曾有報道[16]發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞相關(guān)因子主要在肺腺癌中表達(dá)，但從 Nanog角度國內(nèi)外尚未有相關(guān)報道。

綜上所述，Nanog蛋白和mRNA在NSCLC組織中高表達(dá)，可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；Nanog蛋白的表達(dá)與肺腺癌的預(yù)后有關(guān)。該研究結(jié)果可能為分析NSCLC的生物學(xué)行為、進(jìn)一步開展新的基因治療提供幫助。

[1]Huntly BJ, Gilliland DG. Cancer biology: summing up cancer stem cells[J]. Nature，2005, 435(7046):1169

[2]Chambers I, Colby D, Robertson M, et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells[J]. Cell,2003, 113(5):643

[3]Mak VC, Siu MK, Wong OG, et al. Dysregulated stemness-related genes in gynecological malignancies[J]. Histol Histopathol, 2012, 27(9):1121

[4]鄭文博,潘凌霄,唐煒,等. 乳腺癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011,31(12):2021

[5]王泰齡, 黃受方, 李維華, 等.《全國免疫組織化學(xué)技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會》會議紀(jì)要[J]. 中華病理學(xué)雜志，1996，25(6)：326

[6]陳正堂，朱波. 腫瘤學(xué)專業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展設(shè)想[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011,36(4):315

[7]Yang X, Hou J, Han Z, et al. One cell, multiple roles: contribution of mesenchymal stem cells to tumor development in tumor microenvironment[J]. Cell Biosci,2013, 3(1):5

[8]孫中帥, 雷建園, 廣茜茜, 等.人Sox2和Nanog基因的克隆及其對胎肺成纖維細(xì)胞分化的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2011，36(11):1145

[9]Li XQ, Yang XL, Zhang G, et al. Nuclear β-catenin accumulation is associated with increased expression of Nanog protein and predicts poor prognosis of non-small cell lung cancer[J]. J Transl Med, 2013, 11:114

[10]Hassan KA, Chen G, Kalemkerian GP, et al. An embryonic stem cell-like signature identifies poorly differentiated lung adenocarcinoma but not squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(20):6386

[11]Liu Y, Zhang C, Fan J, et al. Comprehensive analysis of clinical significance of stem-cell related factors in renal cell cancer[J]. World J Surg Oncol，2011, 9:121

[12]Sun C, Sun L, Jiang K, et al.NANOG promotes liver cancer cell invasion by inducing epithelial-mesenchymal transition through NODAL/SMAD3 signaling pathway[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013, 45(6):1099

[13]Looijenga LH, Gillis AJ, Stoop H, et al. Dissecting the molecular pathways of (testicular) germ cell tumour pathogenesis; from initiation to treatment-resistance[J]. Int J Androl,2011, 34(4 Pt 2):e234

[14]Shin S, Mitalipova M, Noggle S, et al. Long-term proliferation of human embryonic stem cell-derived neuroepithelial cells using defined adherent culture conditions[J]. Stem Cells, 2006, 24(1):125

[15]Moreira AL, Gonen M, Rekhtman N, et al. Progenitor stem cell marker expression by pulmonary carcinomas[J]. Mod Pathol, 2010, 23(6):889

[16]文雯, 冀靜, 鄭鵬生.NANOG基因在宮頸癌中的表達(dá)及其意義[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，31(1):26