方 立，王雪晶，荊 婧，馬耀華，鄧文靜，張雯雯，滕軍放

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

自噬是將退變細胞器及長壽命蛋白隔離并運送到溶酶體代謝，以應(yīng)對各種有害刺激[1-2]。自噬有微自噬、分子伴侶自噬和巨自噬3種形式，通過與溶酶體結(jié)合消化大分子物質(zhì)為其主要特點[3]。證據(jù)[4]表明，巨自噬的激活可能在缺血腦組織中起保護作用。重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF)是一種造血生長因子，具有促進中性粒細胞系造血祖細胞增殖分化的能力，近來研究顯示其在神經(jīng)組織的修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。rhG-CSF能顯著減少腦缺血梗死體積，改善早期神經(jīng)功能[5]。然而rhG-CSF對腦缺血神經(jīng)細胞保護的具體機制尚不清楚，其對巨自噬的影響也鮮見報道。自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)是巨自噬的標(biāo)志蛋白。LC3有胞質(zhì)型(LC3Ⅰ)和膜型(LC3Ⅱ)2種類型。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可反映巨自噬水平的高低。作者觀察了缺血對神經(jīng)元細胞和腦缺血大鼠腦組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的影響，探討rhG-CSF對巨自噬的調(diào)控及其可能的神經(jīng)保護機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±30) g，購自河南省實驗動物中心；大鼠神經(jīng)元SH-SY5Y細胞為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院唐北沙教授饋贈；rhG-CSF購自山東泉港藥業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)和MTT購自美國Sigma公司；LC3一抗購自MBL公司，二抗購自美國Santa Cruz公司；免疫組化二步法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2細胞缺氧模型制備與處理SH-SY5Y細胞用DMEM(含體積分數(shù)10%胎牛血清)培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，用氧糖剝奪法制作細胞缺氧模型。將培養(yǎng)基換為預(yù)先以無氧混合氣體(體積分數(shù)95%N2+體積分數(shù)5%CO2)填充30 min的無糖DMEM培養(yǎng)液；然后將細胞立即置于無氧混合氣體填充的密閉容器中，37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h。隨后分別加入0、100、200 μg/L的rhG-CSF，繼續(xù)原環(huán)境培養(yǎng)48 h。

1.2.1 Western blot檢測細胞LC3蛋白的表達 rhG-CSF處理48 h后，抽提細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，取50 μg樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入抗LC3抗體(稀釋300倍)4 ℃過夜，次日加入過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋5 000倍)水平脫色搖床上孵育2 h，用ECL試劑盒使膜上的免疫活性蛋白顯色，暗室中行X線膠片曝光，膠片上蛋白條帶經(jīng)掃描后用Quantity one進行灰度分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。實驗重復(fù)3次。

1.2.2 MDC熒光染色檢測細胞巨自噬空泡 各組細胞rhG-CSF處理48 h后，棄去培養(yǎng)液，多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，用終濃度為0.05 mmol/L的MDC于37 ℃避光溫育60 min后，吸棄染液，PBS洗滌，熒光顯微鏡下(×400)觀察，各組細胞隨機抽取10個不相重復(fù)的視野觀察拍照。流式細胞儀分析。

1.2.3 MTT比色法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，調(diào)整細胞密度為1×107L-1接種于96孔培養(yǎng)板，過夜貼壁后制備體外缺氧模型，4 h后加入不同濃度的rhG-CSF(0、100、200 μg/L)，每組設(shè)8個復(fù)孔，體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。于結(jié)束前4 h，每孔加入MTT液(5 g/L)20 μL；4 h后棄上清培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min左右；結(jié)晶物充分溶解后置酶標(biāo)儀于490 nm波長測吸光度(A)值。細胞活力=實驗孔A值/對照孔A值。

1.3大鼠局灶性腦缺血模型的建立與處理采用改良的Zealonga線栓法建立局灶性腦缺血模型。60只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、rhG-CSF組，每組20只。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，取頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈，于近心端距分叉處4 mm切口插入栓線,沿頸內(nèi)動脈上行,插入長度(19.0±0.5) mm，至大腦中動脈起始部，結(jié)扎栓線，以制成局灶性腦缺血模型。假手術(shù)組手術(shù)過程同上，但不插入線栓。缺血4 h后，假手術(shù)組不予藥物處理；模型組腹部皮下注射生理鹽水50 μg/(kg·d)，連續(xù)5 d；rhG-CSF組腹部皮下注射rhG-CSF 50 μg/(kg·d)，連續(xù)5 d。所有受試動物于注藥7 d后，斷頭快速取腦，自相同斷面(前囟門)將損傷側(cè)大腦冠狀切開。一部分用甲醛固定，石蠟包埋切片；另一部分置液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 Western blot檢測缺血額葉皮層神經(jīng)元LC3蛋白的表達 取出液氮中腦組織移入玻璃勻漿管中，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，冰上充分研碎勻漿。3 500 r/min離心10 min，移棄上清液，按BCA法測蛋白濃度后取50 μg樣品，其余處理同1.2.1。

1.3.2 免疫組化檢測缺血額葉皮層神經(jīng)元LC3蛋白的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟，用檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)熱抗誘導(dǎo)修復(fù)(微波3檔20 min)，室溫下冷卻，PBS洗3次，并用H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶20 min，PBS洗3次，滴加LC3兔抗人多克隆抗體(稀釋200倍)，4 ℃孵育過夜，PBS再次沖洗，二抗孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素襯染，樹脂封片，顯微鏡下隨機選取10個不同視野的細胞觀察，以細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽性細胞。根據(jù)陽性細胞的比率評分：≤50%為 3 分，～65%為 4 分，～75%為5分，>75%為6分。

1.3.3 改良的神經(jīng)功能缺損評分 由不了解實驗分組的人員對動物進行運動(肌肉狀態(tài)、異常動作)、感覺(視覺、觸覺、本體感覺)和反射檢查，綜合評價神經(jīng)系統(tǒng)損傷的嚴重程度。評分最高分為18分，正常為0分，分值越高，說明神經(jīng)損害越嚴重。各組大鼠藥物干預(yù)前進行評分，并于注藥7 d后再次評分。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。各組SH-SY5Y細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、巨自噬空泡數(shù)和細胞活力的比較，以及各組大鼠缺血額葉神經(jīng)元LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3Ⅱ蛋白表達的比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分的比較行重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1rhG-CSF對缺氧SH-SY5Y細胞巨自噬的影響

2.1.1 各組細胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比較 見圖1、表1。

圖1 各組細胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比較

2.1.2 各組細胞巨自噬空泡數(shù)比較 見圖2、表1。

2.1.3 各組細胞活力的比較 見表1。

2.2動物實驗結(jié)果

2.2.1 各組大鼠缺血額葉皮層神經(jīng)元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比較 見圖3、表2。

圖2 各組細胞巨自噬空泡數(shù)比較(×400)

表1 各組細胞巨自噬及細胞活力比較

*:與0 μg/L rhG-CSF組比較，P<0.05；#:與100 μg/L rhG-CSF組比較，P<0.05。

圖3 各組大鼠缺血額葉皮層神經(jīng)元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ檢測結(jié)果

2.2.2 各組大鼠缺血額葉皮層神經(jīng)元LC3蛋白的表達 見圖4、表2。

圖4 各組大鼠缺血額葉皮層神經(jīng)元LC3蛋白的表達(SP,×400)

表2 各組大鼠缺血額葉神經(jīng)元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ及LC3 Ⅱ蛋白表達(n=20)

*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。

2.2.3各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分見表3。

表3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(n=20)

F組間=20.403,F時間=19.193,F交互=33.415,P均<0.001。

3 討論

研究[6]表明，巨自噬作為一種應(yīng)激反應(yīng)，參與了腦缺血的病理生理過程。研究[7]表明rhG-CSF參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)過程。rhG-CSF可減少缺血病灶大小，抑制水腫形成，有抗炎和抗凋亡作用，可以改善中風(fēng)結(jié)局[8]。rhG-CSF還能動員干細胞向病損部位遷移,修復(fù)壞死組織[9]。該研究發(fā)現(xiàn)，體外細胞缺氧模型rhG-CSF給藥組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、巨自噬空泡數(shù)及細胞活力均高于未加藥組，且隨給藥濃度增加，自噬活性及細胞活力均逐漸增強。大鼠腦缺血模型rhG-CSF干預(yù)后第7天，模型組缺血額葉皮層神經(jīng)元的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3表達水平均高于假手術(shù)組，提示局灶性腦缺血后神經(jīng)元巨自噬水平升高，缺血腦組織可能通過增強自噬促進自我修復(fù)；而rhG-CSF組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3表達水平又較模型組增高，表明rhG-CSF干預(yù)可上調(diào)局灶性腦缺血后神經(jīng)元的巨自噬水平。rhG-CSF組較模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低，說明神經(jīng)功能恢復(fù)明顯，提示rhG-CSF有修復(fù)神經(jīng)的作用。

研究[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)巨自噬清除線粒體后神經(jīng)細胞死亡也并非不可避免。Lockshina等[11]認為細胞輕度受損后，自身首先通過激活自噬途徑以清除有害蛋白。缺血再灌注時活性氧(ROS)是自噬的主要誘導(dǎo)因素?；钚匝跽T導(dǎo)線粒體損傷、功能紊亂，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放和形成線粒體碎片，這反過來又促進自噬及自噬清除線粒體?；钚匝跹趸⒁种瓢腚装彼岬鞍酌窤tg4的活化，導(dǎo)致LC3的脂化和自噬體形成[12]。自噬體吞噬消除受損的線粒體，減少活性氧生產(chǎn)，抑制促凋亡因子如細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)短暫腦缺血后，腦組織的自噬標(biāo)記物表達上調(diào)，同時神經(jīng)細胞增加，顯示自噬激活是一個潛在的腦損傷早期保護機制。Yan等[15]也發(fā)現(xiàn)通過藥物預(yù)處理調(diào)節(jié)自噬激活可能減輕缺血細胞損傷。該研究發(fā)現(xiàn)rhG-CSF干預(yù)下局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)細胞自噬水平升高，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，且神經(jīng)元細胞活力增加，提示rhG-CSF能夠上調(diào)腦缺血后巨自噬活動，并促進神經(jīng)功能的修復(fù)。

總之，缺血缺氧損傷后，rhG-CSF可能通過調(diào)控巨自噬水平起到保護神經(jīng)元的作用。

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