王 沖, 王偉瓊，余 建，劉延方，孫 玲，孫 慧，黃 河#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052 2)浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心 杭州 310003

Tara蛋白作為一個(gè)新的F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，由Seipel等[1]在2001年首先鑒定出來。Tara蛋白含有一個(gè)氨基端的PH結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，在酵母及脊椎動(dòng)物中均有廣泛的表達(dá)。有研究[2]表明Tara蛋白不但在調(diào)控肌動(dòng)蛋白及細(xì)胞骨架蛋白的組合過程中起重要作用，在F-肌動(dòng)蛋白的形成中也起關(guān)鍵作用。作者在前期研究[3]中發(fā)現(xiàn)Tara蛋白能夠與E3泛素化連接酶HECTD3結(jié)合進(jìn)而發(fā)生泛素化降解，并且HECTD3能夠通過調(diào)控Tara蛋白的表達(dá)量參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，但Tara蛋白參與細(xì)胞胞質(zhì)分裂的具體機(jī)制并不清楚。為此，作者進(jìn)行了如下研究，探討Plk1磷酸化修飾Tara蛋白對HeLa細(xì)胞胞質(zhì)分裂及增殖的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑人胚腎293T細(xì)胞株及人宮頸癌HeLa細(xì)胞株由浙江大學(xué)血液分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，胎牛血清購自Hyclone公司，青、鏈霉素和DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司，胰蛋白酶購自華美(SABC)公司，Nocodazole、G418購自Sigma公司。

1.2質(zhì)粒含有Flag標(biāo)記的Tara真核表達(dá)質(zhì)粒通過PCR從人睪丸cDNA文庫中擴(kuò)增獲得；BD-Tara、GFP-Tara、Flag-Tara、GST-Tara質(zhì)粒均通過PCR擴(kuò)增Tara片段，于EcoRⅠ或SalⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分別插入pGBKT7、pEGFP-C2、p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pGEX-5X-3質(zhì)粒構(gòu)建而成；Flag-Plk1、GST-Plk1質(zhì)粒通過PCR擴(kuò)增Plk1片段插入p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pGEX-5X-3質(zhì)粒構(gòu)建而成。所有質(zhì)粒均經(jīng)測序證實(shí)。

1.3抗體鼠抗GFP單克隆抗體購自Cell Signaling公司，鼠抗Flag單克隆抗體M2、鼠抗α-tubulin單克隆抗體購自Sigma-Aldrich公司，兔抗Tara多克隆抗體由課題組自行免疫兔并純化獲得，鼠抗Plk1單克隆抗體、鼠抗磷酸化絲氨酸單克隆抗體購自Abcam公司，羅丹明偶聯(lián)羊抗鼠IgG抗體購自Jackson Immunoresearch公司。

1.4其他材料AH109酵母菌種及BL21大腸桿菌菌種由浙江大學(xué)血液分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，人睪丸cDNA文庫、MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3試劑盒購自Clontech公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ、T4 DNA連接酶、pyrobest酶及相關(guān)緩沖液購自TaKaRa公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.5Plk1與Tara的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟按照Clontech公司酵母雙雜交操作手冊及文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，共獲得18個(gè)陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定，并與GenBank進(jìn)行同源性比較。

1.6重組Tara載體轉(zhuǎn)染、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及免疫印跡檢測步驟參照有關(guān)說明書及文獻(xiàn)[4]進(jìn)行操作。

1.7GST融合蛋白純化、體外沉降實(shí)驗(yàn)和Tara蛋白體內(nèi)外磷酸化實(shí)驗(yàn)GST融合蛋白及GST-Tara融合蛋白體外表達(dá)及純化參照Qiagen公司重組GST蛋白純化樹脂說明書操作。純化獲取的重組蛋白質(zhì)4 ℃保存；體外沉降實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見文獻(xiàn)[4]。體外表達(dá)并純化GST及GST-Tara融合蛋白后進(jìn)行體內(nèi)外磷酸化實(shí)驗(yàn)，步驟詳見文獻(xiàn)[4]。

1.8Plk1磷酸化Tara對胞質(zhì)分裂及細(xì)胞增殖的影響以相應(yīng)真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，取出蓋玻片，并以相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測磷酸化Tara對胞質(zhì)分裂的影響，免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟詳見文獻(xiàn)[4]。分別收集轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及其對照的HeLa細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，4 ℃條件下用體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇固定30 min，離心。細(xì)胞重懸于PBS中，加入含有1 mg/L RNA酶的碘化丙啶至20 mg/L，4 ℃避光染色1 h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié)果

2.1Plk1與Tara蛋白酵母雙雜交和免疫共沉淀結(jié)果共轉(zhuǎn)pGADT7-Plk1與pGBKT7-Tara的AH109菌株在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal培養(yǎng)板能夠生長并激活報(bào)告基因。在HeLa細(xì)胞中，內(nèi)源性Plk1能夠與Tara抗體發(fā)生共沉淀反應(yīng)，形成復(fù)合物，而與對照血清無結(jié)合(圖1)。

圖1 Plk1與Tara的免疫共沉淀結(jié)果

2.2Plk1與Tara體外沉降和Plk1體內(nèi)外磷酸化Tara的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GST-Plk1能夠與His-Tara相結(jié)合，形成復(fù)合物，而空GST蛋白則不能將His-Tara沉淀下來(圖2)。將Plk1與Tara進(jìn)行體外磷酸化反應(yīng)，質(zhì)譜結(jié)果顯示T457是Plk1的磷酸化位點(diǎn)。采用PCR定點(diǎn)突變方法將457位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?，體外表達(dá)His-Tara T457A及His-Tara WT融合蛋白，再次進(jìn)行體外磷酸化反應(yīng)，結(jié)果顯示Plk1能夠在體外磷酸化His-Tara WT及對照蛋白，而不能磷酸化His-Tara T457A蛋白 (圖3左)。以100 nmol/L Nocodazole處理HeLa細(xì)胞18 h，收集細(xì)胞前，再分別加入1 μmol/L DMSO或者Plk1特異性小分子抑制劑GW843682X處理8 h，收集細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示加入GW843682X處理后，Tara的磷酸化條帶明顯減弱(圖3右)。

2.3Plk1磷酸化Tara對細(xì)胞胞質(zhì)分離的影響免疫熒光結(jié)果顯示：過量表達(dá)Tara非磷酸化突變體會(huì)導(dǎo)致明顯的染色體排列異常(圖4)。

2.4Plk1磷酸化Tara對HeLa細(xì)胞增殖的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染GFP-Tara T457A的HeLa細(xì)胞4倍染色體發(fā)生率為(51.60±3.71)%，轉(zhuǎn)染GFP空載體、GFP-Tara野生型及GFP-Tara T457E的HeLa細(xì)胞4倍染色體發(fā)生率分別為(5.69±2.36)%、(6.54±2.69)%和(6.91±3.18)%，4組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74 329.277，P<0.001)。

圖2 Plk1與Tara的體外沉降結(jié)果

圖3 Plk1體內(nèi)外磷酸化修飾Tara結(jié)果

圖4 Plk1磷酸化Tara對細(xì)胞胞質(zhì)分離的影響

3 討論

染色體的不穩(wěn)定性同腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制[5]。而腫瘤細(xì)胞正常的胞質(zhì)分裂是一個(gè)極其精細(xì)復(fù)雜的多因素、多環(huán)節(jié)的調(diào)控過程。Plk1作為一個(gè)在細(xì)胞胞質(zhì)分裂過程中起關(guān)鍵作用的磷酸化激酶，在細(xì)胞胞質(zhì)分裂的各個(gè)亞環(huán)節(jié)中均起到了關(guān)鍵調(diào)控作用[6]。作者此前的研究[7-8]已經(jīng)證實(shí)多種端粒相關(guān)蛋白均能夠被Plk1磷酸化修飾進(jìn)而參與有絲分裂進(jìn)程的調(diào)控，但Plk1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的具體機(jī)制目前仍不清楚。Tara蛋白最初作為一個(gè)新的F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白被鑒定出來，此前的研究[1]顯示Tara通過調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白表達(dá)量的變化參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的形成。而作者之前的研究[3]提示Tara蛋白有可能是同時(shí)參與細(xì)胞骨架組成及細(xì)胞有絲分裂調(diào)控的關(guān)鍵信號分子，進(jìn)一步深入探討Plk1及Tara的生物學(xué)功能，將為認(rèn)識細(xì)胞骨架組成和胞質(zhì)分裂之間的聯(lián)系提供新的思路。

在該研究中，作者采用酵母雙雜交的方法成功篩選出的Plk1是一個(gè)新的Tara結(jié)合蛋白。Plk1能夠與Tara在體內(nèi)外相互結(jié)合，能夠在有絲分裂期磷酸化修飾Tara。免疫熒光結(jié)果顯示：Tara非磷酸化突變體能夠?qū)е翲ela細(xì)胞出現(xiàn)大量異常排列的染色體，而野生型和模擬磷酸化突變體則沒有異常表型出現(xiàn)，說明Plk1對Tara的磷酸化修飾對保證細(xì)胞正常的胞質(zhì)分裂是必須的。同時(shí)該研究結(jié)果顯示：過量表達(dá)Tara非磷酸化突變體會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖明顯受阻，表明Plk1可能通過磷酸化Tara參與了對細(xì)胞增殖的調(diào)控，這為進(jìn)一步研究Plk1對細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖調(diào)控提供了新的線索。

綜上所述，該研究證明了Plk1能夠磷酸化并調(diào)控Tara，Tara的非磷酸化突變體能導(dǎo)致細(xì)胞胞質(zhì)分裂及增殖出現(xiàn)異常。

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