臧利敏,吳學(xué)煒,趙雪杰,方先珍,楊曉瑞,王慶端,常俊標(biāo),鄭立運(yùn)#

1)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室 鄭州 450052 2)鄭州安圖綠科生物工程有限公司 鄭州 450016 3)河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心測(cè)報(bào)科 鄭州 450008

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是當(dāng)今人們面臨的主要健康問(wèn)題，全球約有4億人為慢性乙型肝炎感染者[1]。HBV宿主范圍狹窄，建立理想的HBV動(dòng)物模型是有效篩選抗病毒藥物、研究HBV感染機(jī)制和發(fā)病過(guò)程的基礎(chǔ)[2]。鴨乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)是一種禽類(lèi)嗜肝DNA病毒，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組特征、生命周期、生物學(xué)特性等與HBV非常相似[3]。目前, DHBV模型已成為國(guó)內(nèi)外認(rèn)可的抗HBV藥物體內(nèi)活性篩選和評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型。國(guó)內(nèi)已見(jiàn)報(bào)道的DHBV模型鴨主要有北京鴨、重慶麻鴨、廣州櫻桃谷鴨、湖北麻鴨等。通過(guò)雛鴨后天感染DHBV是建立模型的一個(gè)主要途徑，但是鴨體內(nèi)病毒血癥持續(xù)的時(shí)間及水平受鴨種、毒種、產(chǎn)地、感染途徑、感染劑量等多種因素影響，研究結(jié)果間存在一定差異。前期作者從河南本地櫻桃谷鴨血清中分離并克隆了一株DHBV標(biāo)準(zhǔn)毒株。該研究中，作者采用DHBV陽(yáng)性血清人工感染3日齡河南櫻桃谷鴨，建立標(biāo)準(zhǔn)的人工感染河南櫻桃谷鴨乙型肝炎動(dòng)物疾病模型，探討DHBV DNA在動(dòng)物外周血和肝臟中的增殖規(guī)律，并觀察抗病毒藥物拉米夫定(3TC)鴨體內(nèi)的抗病毒效用，驗(yàn)證該模型的科學(xué)性與實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑1日齡河南省櫻桃谷鴨120只，雌雄不拘，體質(zhì)量(50±5) g，購(gòu)買(mǎi)于河南省鄭州市新鄭宏達(dá)鴨業(yè)孵化公司；DHBV-WS病毒株(GenBank No:HM590411.1)由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室分離和保存；DHBV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室構(gòu)建和保存；3TC為葛蘭素史克蘇州有限公司產(chǎn)品；SYBR Green Ⅰ染料購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Viral DNA提取試劑盒和Tissue DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek(美國(guó))公司。

1.2引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank收錄的DHBV S區(qū)核苷酸的保守序列設(shè)計(jì)引物，由北京博尚生物公司合成。上游序列：5’-CGGACAACGGGTCTACTAT-3’，下游序列：5’-GGTGGCAGAGGAGGAAGT-3’。

1.3DHBV陰性鴨的篩選1日齡河南櫻桃谷鴨120只，經(jīng)頸靜脈無(wú)菌采血400 μL， 3 000 r/min離心5 min分離血清，酚/氯仿法提取DNA。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP 4 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL、模板0.5 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g/L 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，155 bp處無(wú)條帶判定為DHBV陰性鴨。

1.4DHBV模型鴨的建立1日齡DHBV陰性鴨48只，在3日齡時(shí)經(jīng)脛靜脈注射采用文獻(xiàn)[3]方法得到的拷貝數(shù)為1.6×106mL-1的DHBV陽(yáng)性血清0.20 mL，于第0、2、4、6、8、10、12、14、21、28、35、42天隨機(jī)抽取，每次剖殺4只，分別按照Viral DNA提取試劑盒、Tissue DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取血清及肝臟DNA。

1.5熒光定量PCR檢測(cè)采用鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室已建立的DHBV熒光定量PCR方法[4]檢測(cè)血清和肝臟中DHBV DNA水平。 反應(yīng)體系為20 μL： SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上、下游引物各0.4 μL，H2O 7.2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性5 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸25 s，共40 個(gè)循環(huán)；40 ℃冷卻10 s。每個(gè)待測(cè)樣本同時(shí)檢測(cè)3管，取平均值。

1.6實(shí)驗(yàn)分組與處理另取1日齡DHBV陰性鴨48只，設(shè)正常組、模型組與3TC組各16只。模型組與3TC組鴨在3日齡時(shí)經(jīng)脛靜脈注射拷貝數(shù)為1.6×106mL-1的DHBV陽(yáng)性血清0.20 mL。7 d后，正常組與模型組灌服生理鹽水2 mL/(kg·d)，3TC組灌服3TC 20 mg/(kg·d)，共給藥10 d。分別在給藥5、10 d后及停藥3 d后隨機(jī)抽取，每次每組剖殺4只，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取血清及肝臟DNA，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)血清和肝臟中DHBV DNA水平。根據(jù)公式計(jì)算DHBV DNA抑制率，抑制率(%)=(模型組拷貝數(shù)-3TC組拷貝數(shù))/模型組拷貝數(shù)×100%。

1.7肝臟病理學(xué)檢查用藥前、用藥10 d后處死正常組、模型組和3TC組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，后取肝左葉中部1.0 cm×1.0 cm大小肝組織固定于甲醛溶液，石蠟包埋、切片后HE染色，切片厚度為5 μm，光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察肝組織病變。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0處理，不同組別不同時(shí)間點(diǎn)鴨血清和肝臟中DHBV DNA拷貝數(shù)的比較采用2×3析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1DHBVDNA在模型鴨血清和肝臟中的增殖情況3日齡櫻桃谷鴨經(jīng)脛靜脈接種DHBV陽(yáng)性血清后，血清和肝臟中DHBV DNA水平的變化見(jiàn)圖1。感染2 d后，48只雛鴨血清均可檢測(cè)出DHBV DNA;在第2至14天，病毒量隨著時(shí)間呈上升趨勢(shì)，并于感染后第14天達(dá)到高峰，拷貝數(shù)達(dá)到7.7×109mL-1；第14至42天，血清DHBV DNA水平呈緩慢下降趨勢(shì)；第6至42天，血清DHBV DNA拷貝數(shù)均維持在較高水平。肝組織中DHBV DNA含量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)與血清中基本一致。

圖1 模型鴨血清和肝臟中DHBV DNA水平動(dòng)態(tài)變化圖

2.2模型組和3TC組鴨血清和肝臟DHBVDNA的水平模型組和3TC組鴨用藥后血清和肝臟中DHBV DNA拷貝數(shù)比較結(jié)果見(jiàn)表1、2。3TC組在用藥第10天，血清和肝臟DHBV DNA抑制率分別達(dá)到86.5%和84.9%；停藥3 d后，DHBV DNA抑制率分別為79.7%和73.4%，即出現(xiàn)輕度的“反彈”現(xiàn)象。

表1 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)鴨血清中DHBV DNA拷貝數(shù)(n=4)(×108 mL-1)

F組間=17.625，F(xiàn)時(shí)間=68.141，F(xiàn)交互=134.517，P<0.001。

表2 不同組別、不同時(shí)間點(diǎn)鴨肝臟中DHBV DNA拷貝數(shù)(n=4)(×108 mL-1)

F組間=69.430，F(xiàn)時(shí)間=35.330，F(xiàn)交互=75.770，P<0.001。

2.3各組鴨肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。正常組鴨肝細(xì)胞呈梭狀，結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰。用藥前，模型組與3TC組肝組織部分細(xì)胞腫脹和出現(xiàn)空泡，匯管區(qū)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及灶性壞死。模型組鴨肝臟在用藥10 d后出現(xiàn)胞質(zhì)疏松化、大量空泡、重度脂肪變性、水樣變性和灶狀壞死。與模型組相比，3TC組在用藥10 d后病變細(xì)胞明顯減少，炎癥有很大程度減輕。

3 討論

HBV具有明顯的種屬特異性，宿主范圍狹窄。已報(bào)道[5]的HBV模型動(dòng)物主要有黑猩猩、樹(shù)鼩、土撥鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠、地松鼠、旱獺、鴨等。相比之下，鴨具有來(lái)源廣、價(jià)格低、易于飼養(yǎng)、繁殖率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)用于篩選評(píng)價(jià)抗HBV藥物的動(dòng)物模型主要以DHBV模型為主。

DHBV模型建立的方法分為先天感染和后天感染兩種。國(guó)內(nèi)先天感染模型通常采用大批量篩選DHBV陽(yáng)性鴨的方法[6-7]，所需樣本量較大，一般選用自然感染率較高的品種。前期調(diào)查研究[3]發(fā)現(xiàn)，河南省櫻桃谷鴨DHBV陽(yáng)性率為8.1%，自然感染率較低，適宜建立后天感染模型。后天感染主要通過(guò)給1～3日齡雛鴨注射病毒陽(yáng)性血清造成慢性攜帶狀態(tài)。研究[8]表明，雛鴨體內(nèi)免疫系統(tǒng)尚未成熟，容易形成免疫耐受，攻毒后病毒血癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且穩(wěn)定。病毒血癥的水平與所感染的 DHBV 毒株毒力強(qiáng)弱有很大的關(guān)系。該模型中病毒株的來(lái)源為河南櫻桃谷鴨DHBV的一株分離株，其基因序列明確，易感性較高，經(jīng)脛靜脈注射后3日齡雛鴨感染率為100%。采用DHBV 1.6×106mL-1拷貝數(shù)陽(yáng)性血清0.20 mL感染3日齡雛鴨，連續(xù)觀察42 d，發(fā)現(xiàn)可維持較高的病毒血癥而無(wú)明顯的自然轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象, 具有良好的穩(wěn)定性。其血清和肝臟中DHBV DNA分別在14、21 d達(dá)到高峰，在42 d內(nèi)保持較高的水平。與鄧學(xué)龍等[9]報(bào)道的廣州櫻桃谷鴨模型相比，病毒血癥持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。胡權(quán)等[10]建立的湖北麻鴨乙肝模型，采用DHBV DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清感染雛鴨，第7天出現(xiàn)病毒血癥，第11天達(dá)到峰值，第33天開(kāi)始逐漸下降，與該研究結(jié)果也有一定差異?？笻BV藥物篩選動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，用藥時(shí)間一般為10～15 d，該模型血清和肝臟中DHBV DNA 連續(xù)觀察42 d均維持較高水平，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。

圖2 鴨肝組織病理切片(HE，×400)

該研究采用抗HBV藥物3TC對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步證明了模型的可靠性。3TC是第一個(gè)用于治療乙肝的經(jīng)典核苷類(lèi)藥物，1999年在中國(guó)上市。該藥物具有明確的藥理作用，能夠有效地抑制HBV DNA的復(fù)制[11]，改善肝組織病理狀態(tài)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與模型組相比，3TC組鴨用藥后血清和肝臟中不同時(shí)間的DHBV DNA拷貝數(shù)均有明顯下降，在用藥10 d后，血清和肝臟DHBV DNA抑制率分別達(dá)到86.5%和84.9%。而且可觀察到用藥10 d后3TC組鴨肝病理狀態(tài)得到明顯改善。因此，該模型可作為理想的DHBV后天感染疾病模型，為后期HBV的研究和抗HBV藥物的篩選和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

[1]Van Damme P, Zanetti AR, Shouval D, et al. Strategies for global prevention of hepatitis B virus infection[J]. Adv Exp Med Biol, 2010, 659: 175

[2]孔祥平，劉光澤，易學(xué)瑞，等.復(fù)制型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的建立與應(yīng)用[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011，36(9)：954

[3]Jilbert AR, Botten JA, Miller DS, et al. Characterization of age- and dose-related outcomes of duck hepatitis B virus infection[J]. Virology, 1998, 244(2): 273

[4]劉揚(yáng)科, 鄭立運(yùn), ?？?biāo)，等．鴨乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2010, 31(3): 7

[5]張傳濤, 廖志航, 陳東輝, 等. 乙型肝炎病毒感染細(xì)胞與動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀[J]. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 31(10): 1036

[6]張喜武,李永吉,方建,等.丁香苦苷固體脂質(zhì)納米?？锅喴腋尾《镜膶?shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥信息,2011,28(2):107

[7]梁榮感, 蘇何玲, 宋蕓娟, 等. 桂林麻鴨先天性鴨乙肝病毒模型的研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 16(11): 1654

[8]唐霓, 黃愛(ài)龍, 郭樹(shù)華, 等. 鴨乙型肝炎病毒體液免疫血清學(xué)指標(biāo)的系統(tǒng)建立與應(yīng)用[J].中華肝臟病雜志, 2001, 9(1): 13

[9]鄧學(xué)龍, 劉妮, 郭興伯, 等. 亞乙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)感染櫻桃谷鴨后在肝臟和外周血中的動(dòng)態(tài)[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 1997, 14(1): 37

[10]胡權(quán), 方瑗, 張正茂, 等. 湖北麻鴨乙型肝炎病毒體內(nèi)感染模型的建立[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2008, 22(2): 113

[11]付喜花，梁蔚芳，吳小東，等.鴨乙型肝炎病毒YMDD突變株體外耐藥模型建立[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31(4)：633