魯照明，楊 帥，周媛媛，貝維娟，侯桂琴

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶家族(phosphoinositide kinase-related kinase，PIKK)，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種進(jìn)化上保守的蛋白激酶，也是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與多種病理和生理過程，是細(xì)胞生長的中心調(diào)控因子[1-2]。許多研究[3-5]證明，mTOR有望成為腫瘤治療中重要且有前景的分子靶點(diǎn)，其抑制劑如雷帕霉素及其衍生物目前正在許多腫瘤中進(jìn)行臨床前及臨床研究，如宮頸癌、乳癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及小細(xì)胞肺癌等。核糖體蛋白S6激酶 (ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)是mTOR最重要的底物之一，被mTOR磷酸化的p70S6K(p-p70S6K)控制含5’Top結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯起始，是蛋白合成中重要的調(diào)控因子[6]。食管鱗狀細(xì)胞癌(簡稱食管鱗癌)是世界六大常見腫瘤之一，惡性程度高，5 a存活率低于5%[7]，在發(fā)展中國家尤為常見。作者以p70S6K特異性小片段干擾RNA (p70S6K-siRNA) 轉(zhuǎn)染人食管鱗癌EC9706細(xì)胞，分析轉(zhuǎn)染前后雷帕霉素對(duì)細(xì)胞增殖的影響，為人食管鱗癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑EC9706購自上海中科院細(xì)胞庫，胰蛋白酶和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，RPMI 1640培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自美國Hyclone公司，雷帕霉素購自美國Sigma公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，Taq酶、dNTP和DNA Marker購自大連寶生物公司，對(duì)照siRNA(無義對(duì)照siRNA)、p70S6K-siRNA、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG及GAPDH抗體、p70S6K(C-18)抗體及p-p70S6K(Thr421/Ser424)兔抗人多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。p70S6K上游引物：5’-ATGCTGCTTCTCGTCT GG-3’，下游引物：5’-TTGAGTCATCTGGGCTGT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為204 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3’，下游引物：5’-AG GTCCACCACTGACACGTTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為570 bp。引物由上海捷瑞公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種在6孔板中，加RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下進(jìn)行RNA干擾效率的檢測，同時(shí)用未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA的細(xì)胞作對(duì)照。

1.3各組細(xì)胞p70S6KmRNA的檢測分別提取轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA 48 h的EC9706細(xì)胞、轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA 24、48 h的EC9706細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR檢測p70S6K mRNA。PCR反應(yīng)體系25 μL，其中cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，Taq酶0.2 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃終止。反應(yīng)結(jié)束后取p70S6K和GAPDH的PCR產(chǎn)物各10 μL進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以p70S6K與GAPDH條帶灰度值的比值表示p70S6K mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4各組細(xì)胞p70S6K蛋白的檢測分別收集轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA 24、48 h的EC9706細(xì)胞，提取總蛋白，以未轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞為對(duì)照。蛋白上樣量均為30 μg。p70S6K及p-p70S6K一抗分別按1500和1600稀釋，二抗均按110 000稀釋。轉(zhuǎn)膜條件為：半干轉(zhuǎn)膜，12 mA，1 h。50 g/L脫脂奶粉PBST溶液室溫下振搖封閉2 h，加一抗后4 ℃過夜。次日PBST洗3次，5 min/次，然后加二抗室溫下振搖2 h，再用PBST洗3次，5 min/次，ECL發(fā)光液孵育2 min，曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以p70S6K或p-p70S6K與GAPDH條帶灰度值的比值表示p70S6K或p-p70S6K蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5各組細(xì)胞細(xì)胞存活率測定收集轉(zhuǎn)染24 h和未轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞，分別接種于96孔板，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的雷帕霉素(0、25、50、100、150、250、500、1 500 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h；每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定波長490 nm處各孔吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞p70S6K mRNA和蛋白表達(dá)的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，采用2×8析因設(shè)計(jì)的方差分析比較轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA 48 h后，在熒光顯微鏡(×200)下可見明顯綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)95%以上，提示對(duì)照siRNA能順利轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，故認(rèn)為同等條件下p70S6K-siRNA也能轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。

2.2p70S6K-siRNA對(duì)EC9706細(xì)胞p70S6KmRNA表達(dá)的影響見圖1。未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA組、轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA 24 h組和48 h組p70S6K mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(2.00±0.28)、(1.40±0.17)、(0.64±0.09)和(0.32±0.06)，4組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.825，P<0.01)；轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA的EC9706細(xì)胞中p70S6K mRNA表達(dá)較其他組下降，且轉(zhuǎn)染時(shí)間長者其表達(dá)更低(P<0.05)。

2.3p70S6K-siRNA對(duì)EC9706細(xì)胞p70S6K及p-p70S6K蛋白表達(dá)的影響與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染p70S6K-siRNA的EC9706細(xì)胞中p70S6K及p-p70S6K蛋白的表達(dá)降低。見圖2、表1。

圖1 各組細(xì)胞中p70S6K mRNA的表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞中p70S6K及p-p70S6K蛋白的表達(dá)

表1 各組細(xì)胞中 p70S6K和p-p70S6K蛋白的表達(dá)比較 (n=3)

*：與未轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。

2.4雷帕霉素對(duì)p70S6K-siRNA轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)雷帕霉素的敏感性增加。見表2。

表2 雷帕霉素作用后各組EC9706細(xì)胞存活率的比較 (n=3) %

F組間=1 958.000，F(xiàn)劑量=664.919，F(xiàn)交互=55.184，P均<0.001。

3 討論

腫瘤的形成是一個(gè)多步驟、多因素影響的過程，發(fā)病的原因很多，癌基因的激活、信號(hào)通路的異常等都會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，應(yīng)用RNA干擾對(duì)腫瘤基因進(jìn)行沉默抑制，從而為腫瘤的研究及治療尋找新的途徑已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。Matsubara等[8]觀察到利用siRNA干擾mTOR的表達(dá)后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖減慢，凋亡增加，細(xì)胞遷移受到抑制。Jin等[9]觀察到沉默Twist1基因，激活LKB1/AMPK/mTOR通路，下調(diào)mTOR/S6K1活性，降低Mcl-1蛋白的表達(dá)，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。張威等[10]干擾EC9706細(xì)胞中mTOR的表達(dá)，最終抑制了EC9706細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

食管鱗癌是最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)存的治療方法還不能對(duì)其進(jìn)行很好的治療。已有報(bào)道[11-13]證實(shí)PI3K/AKT/mTOR通路的異常激活與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。mTOR通路在EC9706細(xì)胞中異常激活，mTOR抑制劑雷帕霉素在體內(nèi)外均可抑制食管鱗癌細(xì)胞的生長[14-15]。由于 mTOR分子較大(相對(duì)分子質(zhì)量為289 000)，與其作用的蛋白也較多，而p70S6K作為mTOR下游最重要的靶點(diǎn)之一，第389位蘇氨酸可直接被mTOR磷酸化，p-p70S6K可以促進(jìn)延長因子-1a、poly(A)結(jié)合蛋白等蛋白的翻譯及表達(dá)[16]。因此，作者認(rèn)為用siRNA下調(diào)p70S6K的表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)雷帕霉素更加敏感。在檢測p70S6K-siRNA對(duì)p70S6K mRNA的干擾效果時(shí)，作者同時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA，發(fā)現(xiàn)其對(duì)p70S6K無明顯干擾效果，因此在檢測其對(duì)p70S6K蛋白表達(dá)的影響時(shí)未設(shè)此對(duì)照。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，干擾后p70S6K mRNA的表達(dá)及其蛋白的磷酸化水平明顯減低，且雷帕霉素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更加明顯，說明干擾p70S6K表達(dá)后EC9706細(xì)胞對(duì)雷帕霉素敏感性增強(qiáng)。該研究可能為食管鱗癌的分子治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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