周 珂 于弋水

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖和遷移是血管重構(gòu)的直接原因［1］。細(xì)胞外基質(zhì)（Extra—lularmatrix，ECM）的降解 與VSMC的 增 殖 和 遷 移 密 切 相 關(guān)［2］，MMP－9 是降解ECM 的關(guān)鍵酶。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是一種多功能的血管活性肽，研究證實(shí)AngⅡ是誘導(dǎo)VSMC增殖的重要因素，且此作用由血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）介導(dǎo)［3］，但AngⅡ在刺激VSMC增殖的同時(shí)是否影響MMP－9 的表達(dá)，AT1R 拮抗

劑是否影響此作用尚不清楚。本研究以體外培養(yǎng)的VSMC為觀察對(duì)象，研究了AngⅡ和對(duì)VSMC 增殖和MMP－9 表達(dá)的作用及AT1R 拮抗劑－纈沙坦（Valsartan）對(duì)AngⅡ作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 血管緊張素Ⅱ、兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）抗體購(gòu)自北京博奧森（BIOS）公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；抗大鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)司；SP免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢谷歌公司；Access RT－PCR 試 劑盒 購(gòu) 自 美 國(guó)Promega 公 司；RNA 提取試劑Trizol、高糖的DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，引物由Gibco公司合成。

1.2 VSMC 的分離培養(yǎng)與鑒定 體質(zhì)量150～180 g的雄體SD 大鼠購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物中心，斷頸法處死大鼠，無(wú)菌條件下迅速分離主動(dòng)脈，組織貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)，選用第5～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，按1×106個(gè)／ml接種到六孔培養(yǎng)板以及培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用特異性人抗鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體的免疫組化法對(duì)VSMC進(jìn)行鑒定拍片。

1.3 分組 將純化的VSMC 用0.125%胰蛋白酶消化下來(lái)后接種于96孔培養(yǎng)板中無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)孵育24 h，接種密度為2×105／孔，每孔200 μl，空白組只加200μl培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，按以下方法分組：AngⅡ組（A 組）：直接加入1×10－7mol／L的AngⅡ；AngⅡ＋Valsartan組（A＋V 組）：1×10－6mol／L Valsartan作用0.5 h后再加入1×10－7mol／L AngⅡ；Valsartan組（V 組）：直接加入1×10－6mol／L Valsartan；對(duì)照組：不加AngⅡ和Valsartan；各組分別作用24 h。

1.4 MTT 法檢測(cè)VSMC 的增殖率 分別收集各組的細(xì)胞和培養(yǎng)基，以單純的只有培養(yǎng)基者作空白對(duì)照，每孔加入0.5 mg／mL 的MTT20 ul反應(yīng)4 h，加入二甲基亞砜200μl，在波長(zhǎng)570 nm 處測(cè)定平均吸光度（A），每組重復(fù)6孔取其平均A 值。根據(jù)平均吸光度A 值計(jì)算VSMC 相對(duì)增殖率，相對(duì)增殖率＝（實(shí)驗(yàn)組A 值－空白對(duì)照A 值）／（對(duì)照組A 值－空白對(duì)照A 值）×100%

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)MMP－9 蛋白的表達(dá)水平 按以上方法分組，作用24小時(shí)后分別收集各組的細(xì)胞，按照SP試劑盒說(shuō)明書所示步驟進(jìn)行操作。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，磷酸緩沖液代替一抗。采用Image－Pro Plus system6.01專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描，表達(dá)強(qiáng)度用平均吸光度（A）表示。

1.6 RT－PCR 法檢測(cè)VSMC 中MMP－9mRNA 的表達(dá)水平 （1）提取細(xì)胞總mRNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：按以上方法分組，分別作用24小時(shí)后棄去培養(yǎng)基，每107個(gè)細(xì)胞加入1ml Trizol裂解核蛋白體提取總mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；（2）PCR 引物及擴(kuò)增條件：MMP9 片段長(zhǎng) 度 537bp；上 游 引 物 5’TCCACCAACTGAAGTCTCGCCT 3’，下 游 引 物 5’GCACAATCGCCATAATTATCC3’，內(nèi)參β－actin，片段長(zhǎng)度350bp，上游引物5’GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA3’，下游引物為5’CTCTTTGATGTCACGACGATTTC3’，擴(kuò)增條件：48℃逆轉(zhuǎn)錄45 min，94℃放置2 min。循環(huán)條件為：94℃變性30 s，60℃退火2 min，68℃延伸2 min，共循環(huán)40次，最后一個(gè)循環(huán)68℃延伸7 min；（3）PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定：擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中100mV下電泳15min，UVP 生物成像系統(tǒng)將凝膠成像，用Gelwork圖像分析軟件進(jìn)行掃描和灰度值分析，以β－actin作為內(nèi)參照，記錄并計(jì)算MMP－9 條帶與βactin的吸光度值的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)的觀察和鑒定 原代培養(yǎng)4～10 d均可見有細(xì)胞從不同的組織塊邊緣游出。倒置顯微鏡下VSMC胞核多為卵圓形，有胞漿豐富，一個(gè)或多個(gè)核仁，少數(shù)細(xì)胞有雙核或三核。用SP 法免疫細(xì)胞化學(xué)染色，隨機(jī)抽取10 個(gè)視野（0.04 mm2／視野），計(jì)數(shù)平滑肌肌動(dòng)蛋白抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和血管平滑肌細(xì)胞的純度。

2.2 AngⅡ和Valsartan對(duì)VSMC 增殖的影響AngⅡ組與對(duì)照組比較，VSMC 的增殖率升高；AngⅡ＋Valsartan組與AngⅡ組比較，VSMC 的增殖率降低，差異均明顯（P＜0.05）。V 組與對(duì)照組比較，VSMC的增殖率差異不明顯（P＞0.05）（表1）。

2.3 AngⅡ和Valsartan對(duì)MMP－9蛋白表達(dá)的影響AngⅡ組（0.12±0.009）與對(duì)照組（0.05±0.002）比較，MMP－9蛋白表達(dá)升高；AngⅡ＋Valsartan組（0.06±0.002）與AngⅡ組（0.12±0.009）比較，MMP－9蛋白表達(dá)降低，差異均明顯（P＜0.05）（表1）。

表1 各組VSMC的增殖率和MMP－9表達(dá)水平的比較

2.4 AngⅡ和Valsartan對(duì)MMP－9mRNA 表達(dá)的影響 AngⅡ組與對(duì)照組比較，MMP－9mRNA 表達(dá)升高；AngⅡ＋Valsartan 組與AngⅡ組比較，MMP－9mRNA 表達(dá)降低，差異均顯著（P＜0.05）（表1，圖1）。

圖1 MMP－9mRNA 的表達(dá)水平 M 為Marker；1為對(duì)照組；2為AngⅡ組；3為AngⅡ＋Valsartan組；4為Valsartan組

3 討 論

血管重構(gòu)是引起心腦血管病等高血壓病并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，研究表明高血壓病小動(dòng)脈的重構(gòu)特點(diǎn)是以VSMC的增殖和遷移為主［1］。細(xì)胞外基質(zhì)的降解與VSMC的增殖和遷移密切相關(guān)，其含量組成的變化也是高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化等血管重構(gòu)的重要機(jī)制［2］。

AngⅡ是血管病理生理學(xué)的重要介質(zhì)，VSMC的異常增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成均與AngⅡ有關(guān)。AngⅡ?qū)SMC功能的調(diào)節(jié)是多方面的，它可直接作用于VSMC，引發(fā)細(xì)胞收縮或增殖；還可通過(guò)誘導(dǎo)VSMC表達(dá)、釋放多種生物活性物質(zhì)，產(chǎn)生一系列繼發(fā)效應(yīng)；還可通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。

ECM 異常積聚和降解引起血管重構(gòu)是AS及血管損傷再狹窄等血管病變的重要原因［2］，基質(zhì)金屬蛋白酶系（matrix metalloproteinases，MMPs）是介導(dǎo)此過(guò)程最重要的酶類，其中MMP－9是降解細(xì)胞外基質(zhì)尤其是降解阻礙VSMC遷移的基膜成分的關(guān)鍵蛋白酶［4］。Mason等研究發(fā)現(xiàn)，MMP－9過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)VSMC 遷移至血管內(nèi)膜，減少內(nèi) 膜 基 質(zhì) 含 量［5］。為 了 探 討MMP－9 對(duì)VSMC 增殖和遷移的作用，Asahi M 等利用MMP－9 基因缺失的小鼠實(shí)施血管剝脫術(shù)后發(fā)現(xiàn)，VSMC 遷移和增殖明顯減少，MMP－9 活性在正常小鼠動(dòng)脈檢測(cè)不到，然而損傷4 h后其活性明顯增加，在24 h達(dá)到最 高 峰，持 續(xù) 高 表 達(dá) 至7、14 d后 活 性 消 失［6］。VSMC在損傷6 d后遷移至內(nèi)膜，與MMP－9 升高時(shí)間一致。說(shuō)明MMP－9 參與調(diào)節(jié)VSMC 遷移與增殖，其中MMP－9在損傷早期表達(dá)對(duì)VSMC增殖并遷移的作用至關(guān)重要。Cho等利用MMP－9 裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)MMP－9 基因缺失不但有抗VSMCs遷移的作用，而且還能抗細(xì)胞增殖，從而抑制內(nèi)膜增生［7］。

有研究表明MMP－9 的抑制劑BipS 可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC遷移［8］，提示我們AngⅡ促進(jìn)VSMC遷移與MMP－9 有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以大鼠胸主動(dòng)脈的VSMC為研究對(duì)象，觀察0.1μmol／LAngⅡ?qū)?xì)胞增殖和MMP－9mRNA 和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定濃度的AngⅡ可以誘導(dǎo)動(dòng)脈的VSMC 增 殖 和MMP－9mRNA 和 蛋 白 表 達(dá) 增 高，AngⅡ?qū)ρ苤貥?gòu)的作用可能與其誘導(dǎo)VSMC 的MMP－9 的表達(dá)增加有關(guān)，其機(jī)制可能與活化一系列信號(hào)分子并使核轉(zhuǎn)錄因子（NF－KB）磷酸化激活有關(guān)，NF－KB是調(diào)控MMP－9基因的關(guān)鍵因子。

AngⅡ是通過(guò)其受體結(jié)合發(fā)揮作用的，研究表明AngⅡ?qū)е碌难苁湛s、細(xì)胞增殖等促進(jìn)重構(gòu)作用都是通過(guò)AT1R 發(fā)生的［3］。纈沙坦是AT1R 的高度選擇性受體拮抗劑，有研究表明纈沙坦具有劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)高血壓心室重構(gòu)的作用，我們以前的研究證實(shí)纈沙坦可通過(guò)拮抗AngⅡ的局部作用逆轉(zhuǎn)或阻止腦血管重構(gòu)而發(fā)揮腦保護(hù)作用［9］。本實(shí)驗(yàn)用纈沙坦阻斷AT1R 后，發(fā)現(xiàn)與AngⅡ組相比，AngⅡ誘導(dǎo)VSMC的增殖和MMP－9的表達(dá)增高均受到部分阻斷，由此推測(cè)AT1R 介導(dǎo)了AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖和MMP－9的表達(dá)增高，AT1R 拮抗劑可抑制這種作用，減少VSMC 增殖和MMP－9的表達(dá)，這為高血壓病和動(dòng)脈粥樣硬化等血管增殖性疾病的防治提供了理論依據(jù)。

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