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        比伐盧定的聚乙二醇化修飾*

        2013-11-19 10:18:32鄧言波王良友
        合成化學(xué) 2013年1期
        關(guān)鍵詞:濾餅聚乙二醇凝血酶

        何 燕, 鄧言波, 王良友

        (1. 蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院,江蘇 蘇州 215123; 2. 蘇州中科天馬肽工程中心有限公司,江蘇 蘇州 215101)

        比伐盧定(BVLD)是由20個(gè)氨基酸(D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu)組成的水蛭素的衍生物,是凝血酶的直接可逆的二價(jià)抑制劑[1],可以與凝血酶的催化位點(diǎn)和陰離子結(jié)合位點(diǎn)(底物識別位點(diǎn))結(jié)合[2]。BVLD于2000年12月15日被美國FDA批準(zhǔn)上市。

        BVLD是一種合成的多肽藥物,單次劑量為250 mg,價(jià)格昂貴。其在腎功能正常的患者體內(nèi)的清除半衰期為25 min,雖然比伐盧定于2000年被批準(zhǔn)用于經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)的抗凝治療,在2005年被批準(zhǔn)用于接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的抗凝治療[3],但是昂貴的價(jià)格限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此,開發(fā)長效、安全、經(jīng)濟(jì)的類似藥物十分必要。蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇化修飾(PEGylation)后能顯著改善其特性,如增加蛋白質(zhì)對酶的穩(wěn)定性、延長蛋白質(zhì)在血漿中的半衰期、降低抗原性和免疫原性等[4],已有多個(gè)PEG修飾的蛋白藥物上市[5]。

        本文將BVLD多肽鏈7-甘氨酸(Gly)用半胱氨酸(Cys)取代,以PEG定點(diǎn)修飾巰基,采用多肽固相合成法制得[Cys]7-BVLD(2); 2與mPEG-MAL(3a~3c)偶聯(lián)合成了三個(gè)PEG修飾的BVLD衍生物——[Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD(1a), [Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD(1b)和[Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD(1c),其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS確證。PT和TT評價(jià)結(jié)果表明,1a~1c均表現(xiàn)出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性優(yōu)于BVLD。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        創(chuàng)新通恒半制備高效液相色譜儀[Phenomenex C18柱,250 mm×30 mm(100 ?,10 μ),流動(dòng)相A: 0.05%TFA水溶液,B: 0.05%TFA(三氟乙酸)/70%CH3CN/H2O,流速20 mL·min-1,檢測波長215 nm];戴安U3000型高效液相色譜儀[HPLC, Prosphere C18柱,250 mm×4.6 mm(100 ?, 5 μ),流動(dòng)相同前,流速1 mL·min-1]; Bruker MTQ型質(zhì)譜儀。

        固相合成載體CTC樹脂(原始替代度為1.3 mmol·g-1), DCC(N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺), HOBt(1-羥基苯并三氮唑)以及10 種Fmoc-保護(hù)氨基酸,上海吉爾生化公司;TFA, Acros; EDT(乙二硫醇)和TMBS(三甲基溴硅烷), Fluka;聚乙二醇的平均分子量為mPEG2000-OH, mPEG5000-OH和mPEG10000-OH, Sigma;其余所用試劑為分析純。

        1.2 合成

        (1) mPEG-MAL(3a~3c)的合成通法

        在反應(yīng)瓶中依次加入mPEG-OH 1 mmol的CH2Cl2(5 mL)溶液,Et3N 6 mmol和對甲苯磺酰氯6 mmol,攪拌下于室溫反應(yīng)20 h(TLC監(jiān)測)。于40 ℃減壓旋蒸除去溶劑,加預(yù)冷無水乙醚沉降,過濾,濾餅用二氯甲烷溶解,依次用0.1%檸檬酸鈉溶液(3×10 mL),飽和NaCl溶液(3×足量)洗滌,無水Na2SO4干燥12 h,于40 ℃減壓旋蒸除去溶劑,乙醚沉降,抽濾,濾餅干燥得白色粉末mPEG-OTs(Ⅰa~Ⅰc)。

        在反應(yīng)瓶中依次加入Ⅰa~Ⅰc1 mmol的DMF(10 mL)溶液,鄰苯二甲酰亞胺鹽(PPI) 6 mmol, N2保護(hù)下于120 ℃反應(yīng)4 h。于90 ℃減壓旋蒸除去溶劑,依次加入無水乙醇與水合肼, 回流反應(yīng)2 h。于60 ℃減壓旋蒸除去溶劑,殘余物用二氯甲烷溶解,過濾,濾液依次用水(3×10 mL),飽和NaCl溶液(3×足量)洗滌,無水Na2SO4干燥12 h,于40 ℃減壓旋蒸除去溶劑,乙醚沉降,抽濾,濾餅干燥得白色粉末mPEG-NH2(Ⅱa~Ⅱc)。

        在反應(yīng)瓶中加入Ⅱa~Ⅱc1 mmol的二氧六環(huán)(40 mL)溶液,攪拌下于80 ℃加馬來酸酐4 mmol,反應(yīng)30 min。于55 ℃減壓旋蒸除去溶劑,乙醚沉降,抽濾,濾餅用醋酸酐溶解,加入無水醋酸鈉,攪拌下于100 ℃反應(yīng)45 min(反應(yīng)液由淡黃色逐漸變?yōu)楹稚后w)。加水(10倍體積),分液,水層用CH2Cl2(3×10 mL)萃取,合成并有機(jī)層,用飽和NaCl溶液(3×足量)洗滌,無水Na2SO4干燥12 h,于40 ℃減壓旋蒸除去溶劑,乙醚沉降,抽濾,濾餅干燥得淡黃固體3a~3c。

        Ⅰa~3c的產(chǎn)量及產(chǎn)率見表1。

        (2) [Cys]7-BVLD(2)的制備

        CTC樹脂15.00 g, HOBt和HBTu為縮合劑,按照反應(yīng)的投料比,稱取相應(yīng)量的Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-D-Phe-OH和Fmoc-Arg(Pbf)-OH,根據(jù)[Cys]7-BVLD的氨基酸順序,按標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法(圖1)合成 D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Cys7(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-CTC(2-CTC)。按照8 mL·g-1樹脂用量配制并加入裂解液,以混合溶劑[V(TFA) ∶V(苯甲硫醚) ∶V(EDT) ∶V(苯甲醚)=90 ∶5 ∶3 ∶2]為裂解液,于0 ℃反應(yīng)90 min。過濾,濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA,加冷凍無水乙醚(6倍體積)沉淀出白色固體,3 000 rpm離心5 min,濾集固體用水溶解,冰凍干燥至恒重得白色干粉2粗品62 mg。

        表 1 Ⅰa~3c的產(chǎn)量及產(chǎn)率Table 1 Output and yield of Ⅰa~3c

        圖1Fmoc固相多肽合成2-CTC的流程圖
        Figure1The flow chart of the Fmoc solid phase peptide synthesis of 2-CTC
        *V(六氫吡啶) ∶V(DMF)=1 ∶3

        2粗品經(jīng)HPLC純化得2,純度大于95%(HPLC),其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS和氨基酸組成分析確證。由MS分析可知,在1 112.2處有主峰,與理論分子量2 223.99分子帶兩個(gè)電荷一致。2經(jīng)酸性水解(6 mol·L-1鹽酸水溶液,于110 ℃反應(yīng)22 h,下同)的氨基酸組成實(shí)測值與理論值(括號內(nèi))相符:Asp 1.99(2), Glu 4.11(4), Pro 3.09(3), Arg 0.96(1), Gly 4.21(4), Tyr 1.07(1), Phe 1.92(2), Ile 0.99(1), Leu 0.98(1)。

        (3)1a~1c的合成通法

        在反應(yīng)瓶中加入2的水(10 mL)溶液,用5%碳酸氫鈉溶液調(diào)至pH 7~8,加入3a~3c,于室溫反應(yīng)至終點(diǎn)(HPLC監(jiān)測)。HPLC分離提純得1a~1c,純度大于95%, MALDI-TOF-MS分析結(jié)果表明,在4 232附近有一系列峰,相鄰兩峰分子量相差約44,具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)酸性水解的氨基酸組成實(shí)測值與理論值(括號內(nèi))相符。1a: Asp 1.99(2), Glu 4.11(4), Pro 3.09(3), Arg 0.96(1), Gly 4.21(4), Tyr 1.07(1), Phe 1.92(2), Ile 0.99(1), Leu 0.98(1)。1b: Asp 2.00(2), Glu 4.31(4), Pro 3.18(3), Arg 1.03(1), Gly 4.13(4), Tyr 1.02(1), Phe 1.82(2), Ile 1.06(1), Leu 1.03(1)。1c: Asp 1.95(2), Glu 4.06(4), Pro 2.92(3), Arg 0.96(1), Gly 4.21(4), Tyr 1.06(1), Phe 1.92(2), Ile 1.01(1), Leu 0.97(1)。

        1.3 1的抗凝活性評價(jià)

        (1)1的凝血酶原時(shí)間(PT)測定

        將PT試劑和受檢血漿置37 ℃水浴中預(yù)溫5 min。取試管1支,加入受檢血漿0.1 mL,一定量的比伐盧定或1(用pH 7.4的Tris-HCl緩沖液配制成所需終濃度),置37 ℃水浴中預(yù)溫30 s,再加入預(yù)溫的PT試劑0.2 mL,混勻,立即啟動(dòng)秒表計(jì)時(shí)。不斷地傾斜試管至液體流動(dòng)緩慢趨于停止時(shí),記錄所需時(shí)間。重復(fù)三次,取平均值,空白對照為Tris-HCl緩沖液,測試結(jié)果見表2。

        表 2 1的PT評價(jià)數(shù)據(jù)*Table 2 PT evaluation data of 1

        *終濃度/μg·mL-1, 凝固時(shí)間欄括號內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)差

        由表2可見,1a~1c不僅在等質(zhì)量濃度測定條件下仍保留了一定的抗凝活性;而且在等摩爾濃度下也保持了良好的抗凝活性,其中1b的抗凝活性優(yōu)于比伐盧定。

        (2)1的凝血酶時(shí)間(TT)測定

        取受檢血漿0.1 mL于試管中,加入一定量的比伐盧定或1(用pH 7.4的Tris-HCl緩沖液配制成所需終濃度),置37 ℃水浴中,預(yù)溫5 min,再加入0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)化“凝血酶”試劑,同時(shí)啟動(dòng)秒表記錄血漿凝固時(shí)間。重復(fù)三次,取平均值,測試結(jié)果見表3。從表3可以看出,1a~1c均具有較好的抗凝活性(正常對照平均值18.0 s)。

        表 3 1的TT評價(jià)數(shù)據(jù)Table 3 TT evaluation data of 1

        表 4 1的APTT評價(jià)數(shù)據(jù)(等質(zhì)量濃度)*Table 4 APTT evaluation data of 1

        *終濃度0.04 μg·mL-1

        (3) 1的活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)測定

        取APTT反應(yīng)液0.1 mL和受檢血漿0.1 mL于塑料離心管中,并加入5 μL的比伐盧定或1(用pH 7.4的Tris-HCl緩沖液配制成終濃度0.04 μg·mL-1的溶液),置 37 ℃水浴中預(yù)溫3 min。再加入預(yù)溫的APTT催化劑0.1 mL,混勻,立即啟動(dòng)秒表計(jì)時(shí)。不斷地傾斜試管至有絮狀沉淀生成時(shí),記錄所需時(shí)間。重復(fù)三次,取平均值,測試結(jié)果見表4。由表4可見,1a~1c仍保持了良好的抗凝活性,其中,1b的抗凝活性最佳。

        2 結(jié)果與討論

        比伐盧定的構(gòu)效關(guān)系研究表明,其氨基端帶正電荷區(qū)域(D-Phe-Pro-Arg-Pro)和羧基端帶負(fù)電荷區(qū)域(Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu)是其與凝血酶結(jié)合的兩個(gè)關(guān)鍵區(qū)域,而5-位至8-位的4個(gè)Gly只起連接作用,因此選擇7-位或8-位的甘氨酸進(jìn)行聚乙二醇修飾是理想的位點(diǎn)。初步活性評價(jià)表明,本研究合成的三種不同平均分子量的1a~1c能保持較好的體內(nèi)抗凝活性,在相同摩爾濃度下,1b的抗凝活性優(yōu)于比伐盧定,有望進(jìn)一步開發(fā)成具有比比伐盧定更長半衰期的抗凝藥物。

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