陳舒憶, 呂同杰, 嚴(yán)和平, 歐陽貴平

(1. 貴州大學(xué) 精細(xì)化工研究開發(fā)中心 教育部綠色農(nóng)藥和農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室,貴州 貴陽 550025; 2. 紅河學(xué)院 理學(xué)院,云南 蒙自 661100)

自吉非替尼作為治療非小細(xì)胞肺癌的藥物上市以來，隨著埃羅替尼、拉帕替尼的相繼出現(xiàn)，喹唑啉類化合物日益受到研究者的重視，目前已有數(shù)個喹唑啉類化合物進入臨床試驗階段[1]。

表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶是廣泛分布在哺乳動物上皮細(xì)胞膜上的多功能糖蛋白，是細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)的重要樞紐。酪氨酸激酶介導(dǎo)的細(xì)胞生長信號通路在癌癥形成和發(fā)展過程中起重要作用，能調(diào)控細(xì)胞增殖、新陳代謝、細(xì)胞存活和凋亡以及各種生長機制[2]。臨床研究表明，EGFR在許多腫瘤患者中有過表達[3]，因而抗腫瘤藥物的研發(fā)常常以EGFR為靶標(biāo)。喹唑啉類化合物具有良好的生物活性，對EGFR有很強的抑制作用，且具有較高的選擇性[4]，此類化合物能選擇性地與EGFR結(jié)合，競爭性阻礙EGFR與ATP結(jié)合，抑制EGFR自身酪氨酸激酶活化，干擾EGFR的信號傳導(dǎo)，致使腫瘤癌細(xì)胞凋亡。

本研究以吉非替尼為先導(dǎo)，設(shè)計合成了一系列喹唑啉衍生物，并進行初步抗腫瘤活性測試，以期能篩選出高活性化合物。參照文獻[5,6]方法，以異香草醛(1)為起始原料，與1-溴-3-氯丙烷縮合反應(yīng)，然后與鹽酸羥胺生成腈類中間體3; 3經(jīng)硝化、還原，與N,N-二甲基甲酰胺二甲縮醛反應(yīng)，再與3-氯-4-氟苯胺反應(yīng)合環(huán)，最后與一系列的芳香醚(Ⅰa～Ⅰh)反應(yīng)，合成了8個喹唑啉類衍生物8a～8h(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和MS確證。并測定了8對人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37的體外抑制活性。

CompabcdefghAr--MeO-OHCOMe-OHCOMe----

Scheme1

該合成方法操作簡便，省去基團的保護及去保護，有效際避免了氯化試劑帶來的環(huán)境污染，收率較高。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點儀(溫度計未校正)；ECX-500型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));Agilent 1100 MSD-Trap-VL型質(zhì)譜儀；BIO-RAD 680型酶標(biāo)儀。

2～7參考文獻[7]方法合成。7:收率58.3%, m.p.142 ℃～146 ℃;1H NMRδ: 2.27(m, 2H), 3.82(t,J=7.02 Hz, 2H), 3.98(s, 3H), 4.30(t,J=5.75 Hz, 2H), 7.15(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.25(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.80(m, 1H), 7.85(s, 1H), 8.12(m, 1H), 8.51(s, 1H); EI-MSm/z: 396.2{[M+H]+}。柱層析用硅膠，200 目～300 目；其余所用試劑均為分析純。

1.2 8的合成(以8a為例)

在三口瓶中依次加入71.00 g(2.52 mmol), 2,6-二甲基苯酚(Ⅰa) 0.61 g(5.00 mmol), K2CO30.76 g(5.00 mmol)和DMF 15 mL，攪拌下回流反應(yīng)4 h(TLC跟蹤)。冷卻至室溫,傾入水中靜置析晶，過濾，濾餅經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:V(氯仿) ∶V(甲醇)=20 ∶1]純化得淡黃色固體8a0.66 g。

表 1 合成8的實驗結(jié)果Table 1 Experimental results of synthesizing 8

表 2 8的NMR數(shù)據(jù)Table 2 NMR data of 8

續(xù)表2

Comp1H NMR δ(J/Hz)13C NMR δ8h2.22(s, 3H), 2.29(m, 2H), 3.94(s, 3H), 4.15(t, J=5.75, 2H), 4.31(t, J=5.75, 2H), 6.85(s, 1H), 6.87(s, 1H), 7.07(s, 1H), 7.09(s, 1H), 7.44(t, J=9.15, 1H), 7.80(m, 1H), 7.84(s, 1H), 8.12(d, J=9.15, 1H), 8.51(s, 1H), 9.55(s, 1H)20.59, 29.23, 56.40, 64.55, 66.15, 103.02, 107.84, 109.27, 114.78, 116.94, 119.21, 122.83, 123.98, 129.74, 130.38, 137.31, 147.55, 148.73, 152.69, 153.18, 154.94, 156.52, 156.83

用類似的方法合成白色固體8b～8h,實驗結(jié)果見表1, NMR數(shù)據(jù)見表2。

1.3 體外抗腫瘤活性測定

8的體外抗腫瘤活性初步篩選試驗均以DMSO作空白對照，阿霉素作為陽性對照。采用MTT法測定8對人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37的抑制作用。

取對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞Bcap-37,以2×103個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL。在5%CO2氣氛中于37 ℃置含10%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞生長90%左右時，吸掉培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含不同濃度供試化合物的含血清培養(yǎng)基，每個供試化合物設(shè)2個劑量組(1 μmol·L-1, 10 μmol·L-1),每組設(shè)6個平行孔,對照組加入與藥等體積的溶劑,繼續(xù)培養(yǎng)至試驗設(shè)計時間。去除上清,每孔加入100 μL濃度為0.5 mg·mL-1的MTT溶液(1×PBS配制)。于37 ℃避光溫育4 h;每孔再補加10% SDS 100 μL,再培養(yǎng)10 h。從培養(yǎng)箱中取出,靜置30 min(使其冷卻),置振板器上振蕩10 min(使結(jié)晶物充分溶解)。于酶標(biāo)儀595 nm處測量各孔吸收值(OD值)。試驗設(shè)空白對照組(細(xì)胞、化合物溶媒、培養(yǎng)液、MTT和DMSO)和調(diào)零組(培養(yǎng)基、MTT和DMSO)，按下式計算供試化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制率(%)。

2 結(jié)果與討論

8的體外抗腫瘤活性測試結(jié)果見表3。由表3可見,除8c和8d外,8a,8b,8e～8h對乳腺癌細(xì)胞Bcap-37抑制率較高，部分抑制率與對照藥劑阿霉素相當(dāng)。根據(jù)目前對喹唑啉衍生物活性的研究[8]可知，對于4-苯胺基-6,7-二取代喹唑啉類化合物，4-位苯胺基與6-或7-位取代基團對化合物的活性有至關(guān)重要的作用。文獻[9]報道4-位苯胺基的H替換為F, Cl, Br或I可提高抗腫瘤活性。本試驗通過對喹唑啉6-位長鏈上苯醚結(jié)構(gòu)的研究得知，含甲氧基、甲基等供電子基團能增強化合物對乳腺癌細(xì)胞Bcap-37的抑制活性；而含有醛基等吸電子基團的化合物抗腫瘤活性不明顯。

表 3 8的體外抗腫瘤活性*Table 3 Antitumor activities of 8 in vitro

*測試方法見1.3

3 結(jié)論

本文以異香草醛為原料，經(jīng)醚化、氰基化、硝化、還原、合環(huán)后，再與一系列芳香醚反應(yīng)，設(shè)計合成了8個喹唑啉類化合物，并用MTT法測定其抗腫瘤活性。初步活性測試結(jié)果表明，具有喹唑啉環(huán)基本結(jié)構(gòu)的化合物8a～8h均對乳腺癌細(xì)胞Bcap-37具有一定程度的體外抑制作用，部分化合物抑制率與對照藥劑阿霉素相當(dāng)，顯示了較好的抗腫瘤活性。

[1] 張萬年,繆震元. 抗腫瘤創(chuàng)新藥物研究進展[J].中國新藥雜志,2010,19(24):2277-2289.

[2] Mendelsohn J. Blockade of receptors for growth factors:An anticancer therapy-the fourth annual Joseph H.burchenal american association for cancer research clinical research award lecture[J].Clin Cancer Res,2000,6:747-753.

[3] Wong A J, Bigner S H, Bigner D D,etal. Increased expression of the epidermal growth factor receptor gene in malignant gliomas is invariably associated with gene amplification[J].Medical Sciences,1987,84:6899-6903.

[4] Khaled Abouzid, Samia Shouman. Design,synthesis and in vitro antitumor activity of 4-aminoquinoline and 4-aminoquinazoline derivatives targeting EGFR tyrosine kinase[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,16:7543-7551.

[5] Chandregowda V, Venkateshwara Rao G, Chandrasekhara Reddy G. Convergent approach for commercial synthesis of gefitinib and erlotinib[J].Org Process Res Dev,2007,11:813-816.

[6] Chandregowda V, Venkateshwara Rao G, Chandrasekhara Reddy G. One-pot conversion of 2-nitrobenzonitriles to quinazolin-4(3H)-ones and synthesis of Gefitinib and Erlotinib hydrochloride[J].Heterocycles,2007,71:39- 48.

[7] 呂同杰,歐陽貴平. 吉非替尼的合成[J].廣州化工,2010,38(12):154-156.

[8] 白俊生. 新型4-氨基喹唑啉類化合物的設(shè)計與合成[D].長春:吉林大學(xué),2009.

[9] 劉靖,王林,楊曉明. 多靶點蛋白酪氨酸激酶抑制劑的研究進展[J].國際藥學(xué)研究雜志,2009,36(3):161-171.