丁 丹, 沈平孃, 祁雙紅, 湯秀珍, 鄒蓮華, 杜晨杰, 卓 超

(1. 華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237; 2. 國家中藥制藥技術(shù)工程研究中心,上海 201203)

茄科類植物龍葵是我國民間常用于治療腫瘤的一種草藥[1]。 龍葵提取物中主要成分為澳洲茄邊堿和澳洲茄堿,它們是澳洲茄胺(4)的兩個三糖苷化合物,對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[2～6]。近年來,國內(nèi)外關(guān)于甾體糖苷的合成,抗腫瘤活性及其作用機(jī)制的研究較多[7～11]。然而關(guān)于4的糖甙化和結(jié)構(gòu)修飾的報道不多。本課題組對4進(jìn)行3-位糖甙化合成,并篩選抗腫瘤活性,探索在4的3-位羥基引入不同的單糖對抗腫瘤活性的影響。

本文以單糖[D-葡萄糖(1a)， D-半乳糖(1b), L-鼠李糖(1c), D-氨基葡萄糖(1d)和L-阿拉伯糖(1e)]進(jìn)行4的單糖苷化。1a～1e經(jīng)苯甲酰化保護(hù)及溴代制得中間體?；宕?a～3e。用Koenigs-Knorr合成法將3a～3e與4進(jìn)行甙化縮合及脫保護(hù)基反應(yīng)合成了5個澳洲茄

Ar=

Scheme1

胺單糖苷(5a～5e， Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和MS表征。其中5a和5b分別是γ-solamargine和γ-solasonin屬天然澳洲茄胺單糖苷,而5c, 5d和5e是非天然澳洲茄胺糖苷化合物，5d和5e是新化合物。采用MTT法對人肺癌細(xì)胞(A549),人肝癌細(xì)胞(QGY7703),人白血病細(xì)胞(HL-60),人腸癌細(xì)胞(Colo205)和人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MD-435,231)進(jìn)行了體外抗腫瘤活性試驗(yàn)。結(jié)果顯示在4的3-位引入不同的單糖，增強(qiáng)了其抗腫瘤活性, 其中5c和5d的活性要強(qiáng)于5a, 5b和5e; 5d對MDA-MB-231和HL-60有較好的抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SGW X-4型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正);Brukor AVANCE(400 MHz或100 MHz)型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));HP5989A型低分辨質(zhì)譜儀(EI-MS)； Finigann MAT 8401型高分辨質(zhì)譜儀(HR-MS); WellscanMK-2型全自動酶標(biāo)儀。

培養(yǎng)液(RPMI1640+10%FBS+雙抗)，A549， QGY7703， HL-60， Colo205和MDA-MB-435,231,上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)3的制備(以3a為例)

在反應(yīng)瓶中加入1a4 g(22 mmol),二氯甲烷60 mL和三乙胺13.6 g(130 mmol),攪拌下于-4 ℃滴加苯甲酰氯14.3 mL(120 mmol)，滴畢，于室溫反應(yīng)16 h。加水60 mL和二氯甲烷30 mL，分液，有機(jī)層依次用水，稀鹽酸，飽和NaHCO3溶液和飽和NaCl溶液洗滌，無水MgSO4干燥，旋干溶劑得黃色漿狀粗品,丙酮/水重結(jié)晶得白色固體1,2,3,4,6-五-O-苯甲酰-β-D-葡萄糖(2a)10.8 g。

在反應(yīng)瓶中加入2a10.8 g(15.4 mmol)和二氯甲烷70 m，冰浴冷卻,攪拌下滴加30%溴化氫5.5 mL(30.0 mmol)的醋酸溶液,滴畢，于室溫反應(yīng)8 h。加冰水50 mL，依次用冰水(3×50 mL),飽和碳酸氫鈉溶液(4×55 mL)和飽和NaCl溶液(2×55 mL)洗滌,無水MgSO4干燥,旋干溶劑得淺黃色漿狀粗品,用乙醚/石油醚重結(jié)晶得白色粉末1-溴-2,3,4,6-四-O-苯甲酰-α-D-吡喃葡萄糖(3a)6.48 g。

用類似的方法合成白色固體3b～3e。

3a： 收率45.0%(以1a計，下同),m.p.128 ℃～129 ℃,；1H NMR(CDCl3)δ： 6.89(d,J=4.0 Hz, 1H, 1-H), 5.36(dd,J=10.0 Hz, 4.0 Hz, 1H, 2-H), 5.85(t,J=10.0 Hz, 1H, 3-H), 6.29(t,J=10.0 Hz, 1H, 4-H), 4.76(m, 1H, 5-H), 4.69(dd,J=12.4 Hz, 2.4 Hz, 1H， 6-Ha), 4.53(dd,J=12.4 Hz, 2.4 Hz, 1H， 6-Hb)。

3b： 收率67.2%, m.p.130 ℃～132 ℃；1H NMR(CDCl3)δ： 8.10～7.26(m, 20H, PhH), 7.00(d,J=4.0 Hz, 1H, 1-H), 6.14 (d,J=3.2 Hz, 1H, 2-H), 6.08(dd,J=10.4 Hz, 3.2 Hz, 1H, 3-H), 5.70(dd,J=10.8 Hz, 3.6 Hz, 1H, 4-H), 4.95(t,J=6.0 Hz, 1H, 5-H), 4.67(dd,J=12.0 Hz, 6.8 Hz, 1H, 6-Ha), 4.49(dd,J=11.2 Hz, 6.0 Hz, 1H, 6-Hb)。

3c： 收率73.9%， m.p.162 ℃～164 ℃；1H NMR(CDCl3)δ： 8.11～7.29 (m, 15H, Bz-H), 6.57(s, 1H, 1-H), 6.21(dd, 1H, 3-H), 5.89(dd, 1H, 2-H), 5.79(t, 1H, 4-H), 4.44 (m, 1H, 5-H), 1.44(d, 3H, CH3)； EI-MSm/z: 459.1[M-79(-Br)]。

3d： 收率71.4%, m.p.126 ℃～127 ℃；1H NMR(CDCl3)δ： 8.16～7.23(m, 20H, PhH), 6.39(d,J=7.2 Hz, 1H, 1-H), 5.92(d,J=8.6 Hz, 1H, NH), 5.64(d,J=8.0 Hz, 1H, 2-H), 5.94(s, 1H, 3-H), 4.68(m, 1H, 4-H) , 4.06(m, 1H, 5-H), 4.69(dd, 1H, 6-Ha), 4.52(dd, 1H, 6-Hb)；13C NMR(CDCl3)δ: 166.1, 165.1, 165.0, 164.7, 133.5, 133.4, 133.1, 132.3, 130.0, 129.7, 129.5, 129.3, 129.1, 128.7, 128.6,128.5, 128.4, 128.3, 126.4, 99.8(C1), 69.6(C3), 68.4(C2), 68.3(C4), 64.5(C6), 64.2 (C5)。

3e： 收率35.0%， m.p.122 ℃～125 ℃；1H NMR(CDCl3)δ： 6.68(d,J=3.6 Hz, 1H, 1-H), 5.80(s, 1H, 4-H), 5.78(dd, 1H, 3-H), 4.44(dd, 1H, 2-H), 4.29(dd, 1H, 5-Ha), 4.11(dd, 1H, 5-Hb)；13C NMR(CDCl3)δ: 166.1, 165.9, 165.7, 133.5, 133.4, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.2, 128.9, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 91.3(C1), 70.2( C5), 69.7(C2), 67.7( C4), 60.6( C3)。

(2)5的制備(以5a為例)

在反應(yīng)瓶中加入3a2.1 g(3.2 mmol), 4 0.73 g(1.77 mmol)和無水二氯甲烷45 mL，攪拌至澄清。加入活化4?分子篩7 g，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于-10 ℃慢慢加入AgSO3CF30.82 g(3.19 mmol)的無水甲苯(8 mL)溶液,于室溫反應(yīng)2 h。加入二氯甲烷40 mL，抽濾，旋干濾液得黃色糖漿狀粗品，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=45 ∶1]分離得3β-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰-β-D-葡萄糖)-solasodine(A)0.88 g。

在反應(yīng)瓶中加入A 1.2 g(1.71 mmol)，甲醇15 mL和1 mol·L-1NaOH的甲醇(6.8 mL, 6.8 mmol)溶液，攪拌下于室溫反應(yīng)3 h。旋干溶劑后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=10 ∶1)分離得白色固體3β-O-β-D-葡萄糖-solasodine(5a)0.53 g。

用類似的方法合成白色固體5b～5e。

5a： 收率52.4%(以3a計，下同)，m.p.153 ℃～154 ℃；1H NMRδ： 5.34(d, 1H, 6-H), 4.89(d,J=4.8 Hz, 1H, 1′-H), 4.86(dd, 1H, 2′-H), 4.43(t, 1H, 3′-H), 4.22(d, 1H, 4′-H), 3.65(dd, 1H, 6′-Ha), 3.48(m, 1H, 3-H), 3.42(dd, 1H, 6′-Hb), 3.15(m, 1H, 5′-H), 1.23(d, 3H, 21-CH3), 0.98(s, 3H, 19-CH3), 0.87(d, 3H, 27-CH3), 0.76(s, 3H, 18-CH3)；13C NMR(CD3OH)δ: 140.6(C5), 120.9(C6), 101.1(C1′), 98.9(C22), 83.3(C16), 78.3(C2′), 76.6(C3′), 76.4(C4′), 73.3(C3), 70.2(C5′), 61.5(C17), 61.3(C6′), 56.2(C14), 50.1(C9), 45.3(C26), 41.4(C13), 40.7(C12), 38.9(C4), 38.2(C10), 37.1(C1), 36.6(C20), 31.8(C8), 31.6(C15), 31.7(C7), 31.3(C25), 29.2(C23), 28.0(C24), 27.4(C2), 20.4(C11), 18.4(C19), 17.2(C27), 15.1(C18), 13.3(C21)； EI-MSm/z: 575.4(M+)。

5b： 收率77.7%， m.p.185 ℃～187 ℃；1H NMRδ： 5.40(t, 1H, 6-H), 4.73(d,J=4.0 Hz, 1H, 1′-H), 4.67(d, 1H, 2′-H), 4.53(m, 1H, 5′-H), 4.32(d, 1H, 3′-H), 4.17(d, 1H, 4′-H), 3.60(m, 1H, 6′-Ha), 3.50(m, 1H, 3-H), 3.43(m, 1H, 6′-Hb), 1.16(d, 3H, 21-H), 1.08 (s, 3H, 19-H), 1.01(d, 3H, 27-H), 0.86(s, 3H, 18-H)；13C NMR(CD3OH)δ: 140.7(C5), 120.9(C6), 101.7(C1′), 98.9(C22), 83.2(C16), 78.3(C2′), 75.1(C3′), 73.6(C3), 71.2(C4′), 68.9(C5′), 61.5(C17), 61.1(C6′), 56.2(C14), 50.1(C9), 45.3(C26), 41.4(C13), 40.7(C12), 38.9(C4), 38.3(C10), 37.1(C1), 36.6(C20), 31.8(C8), 31.6(C15), 31.7(C7), 31.3(C25), 29.3(C23), 28.1(C24), 27.5(C2), 20.4(C11), 18.4(C19), 17.2(C27), 15.1(C18), 13.3(C21)； EI-MSm/z: 576.0(M++1)。

5c： 收率78.7%， m.p.176 ℃～178 ℃(180 ℃～181 ℃[11])；1H NMR(CD3OH)δ： 5.40(d, 1H, 6-H), 4.86(d, 1H, 1′-H), 3.67(dd, 1H, 2′-H), 3.66(dd, 1H, 3′-H), 3.45(m, 1H, 3-H), 3.38(t, 1H, 4′-H), 3.33(m, 1H, 5′-H), 1.26(d, 3H, 6′-CH3), 1.06(d, 3H, 21-CH3), 0.97(s, 3H, 19-CH3), 0.89(d, 3H, 27-CH3), 0.76(s, 3H, 18-CH3)；13C NMR(CD3OH)δ: 140.4(C5), 121.1(C6), 98.8(C1′), 98.3(C22), 82.9(C16), 72.7(C3), 71.3(C2′), 76.5(C4′), 71.0(C3′), 68.5(C5′), 61.6(C17), 56.2(C14), 50.1(C9), 45.5(C26), 41.4(C13), 40.7(C12), 38.9(C4), 38.2(C10), 37.1(C1), 36.6(C20), 32.0(C8), 31.7(C7), 31.6(C15), 31.2(C25), 29.2(C23), 28.2(C24), 27.7(C2), 20.5(C11), 18.4(C19), 17.3(C27), 16.6(C6′), 15.2(C18), 13.4(C21)； EI-MSm/z: 560.0(M++1)。

5d： 收率66.1%， m.p.184 ℃～185 ℃；1H NMRδ: 8.16～7.48(m, 5H, PhH), 8.57(s, 1H, NH), 5.96(t,J=10.0 Hz, 1H, 4′-H), 5.58(t,J=9.6 Hz, 1H, 3′-H), 5.23(s, 1H, 6-H), 5.10(d,J=8.4 Hz, 1H, 1′-H), 4.22(t,J=8.4 Hz, 1H, 2′-H), 4.22(t, 1H, 5′-H), 4.53(dd, 1H, 6′-Ha), 4.46(dd, 1H, 6′-Hb), 3.47(m, 1H, 3-H), 1.13(d, 3H, 21-CH3), 0.86(s, 3H, 19-CH3), 0.79(d, 3H, 27-CH3), 0.72(s, 3H, 18-CH3)；13C NMR(CD3OH)δ: 169.5(PhCO), 140.5(C5), 121.1(C6), 134.9, 131.2, 128.2, 121.0, 100.0(C1′), 98.4(C22), 81.2(C16), 79.1(C2′), 76.5(C3), 74.4(C3′), 70.9(C4′), 62.1(C6′), 61.5(C5′), 56.9(C17), 56.2(C14), 50.1(C20), 46.3(C9), 46.1(C26), 41.4(C4), 40.5(C12), 39.2(C13), 38.8(C1), 37.0(C8), 36.5(C15), 32.7(C7), 31.7(C2), 31.3(C23), 29.3(C25), 29.0(C24), 20.5(C11), 18.5(C19), 17.9(C18), 15.4(C21), 13.8(C27)； HR-MS： Calcd for C40H58N2O7(M+) 678.424 4, found 678.424 3。

5e： 收率65.9%， m.p.136 ℃～138 ℃；1H NMR(CD3OH)δ： 5.51(s, 1H, 1′-H), 5.39(d, 1H, 6-H), 4.32(m, 1H, 4′-H), 3.86(dd, 1H, 3′-H), 3.82(s, 1H, 2′-H), 3.38(s, 1H, 3-H), 3.53(m, 2H, 5′-Hb, Ha), 1.07(s, 3H, 19-H), 1.06(d, 3H, 21-CH3), 0.92(d, 3H, 27-CH3), 0.86(s, 3H, 18-CH3)；13C NMR(CD3OH)δ： 140.6(C6), 121.0(C5), 101.7(C1′), 98.4(C22), 78.3(C16), 72.9(C3), 71.0(C2′), 68.3(C3′), 65.5(C4′), 62.1(C17), 56.5(C14), 52.2(C5′), 50.2(C9), 46.4(C26), 41.4(C13′), 40.4(C4), 39.3(C12), 38.3(C10), 37.1(C20), 36.6(C15), 31.7(C25), 31.6(C8), 31.3(C7), 29.3(C23), 28.1(C24), 20.5(C11), 18.4(C19), 17.8(C27), 15.3(C18), 13.7(C21)； HR-MS： Calcd for C32H51NO6: 545.371 6(M+), found 545.371 9。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

甾體皂甙的合成方法較多[12]，其中Koenigs-Knorr和Schmidt法最常用。鹵代?；呛腿纫阴啺孵ヵ；鞘莾蓚€重要中間體,鹵代酰化糖制備較成熟容易，為此研究選擇Koenigs-Knorr的甙化方法。以苯甲酰氯[n(1) ∶n(酰氯)=1.0 ∶6.1或1.0 ∶5.1]在吡啶或三乙胺作用下制備全苯甲?；?a～2e,反應(yīng)跟蹤及純化容易;2a～2e與30%溴化氫醋酸溴化劑[n(2) ∶n(溴化劑)=1.0 ∶2.0]反應(yīng)制備中間體溴代?；?a～3e;在-10 ℃～-5 ℃,無氧無水條件下,無水二氯甲烷和無水甲苯為溶劑,分子篩除水,以等摩爾量的AgSO3CF3催化,3a～3e與4縮合反應(yīng)2 h～3h,然后在甲醇/甲醇鈉作用下脫保護(hù)基合成了5a～5e,兩步收率約70%。在等摩爾量硝酸銀催化下,反應(yīng)無需氮?dú)獗Ｗo(hù), 在0 ℃～室溫反應(yīng)4 d～10 d,3a～3e與4縮合反應(yīng)亦可得到5a～5e,收率52%～73%,反應(yīng)操作簡便容易。

根據(jù)1H NMR端位氫的判斷規(guī)則[13],對3a～3e和5a～5e的甙鍵構(gòu)型進(jìn)行初步分析,1a,1b和1d適合該規(guī)則,3a,3b和3d的端位氫3J1,2分別為4.0 Hz, 4.0 Hz和7.2 Hz,因此3a,3b的甙鍵可確定為α-D構(gòu)型,而3d為β-D構(gòu)型。3a,3b和3d與4甙化縮合物端位氫3J1,2分別為8.0 Hz, 7.6 Hz和8.4 Hz,因此它們以及5a, 5b和5d糖甙鍵確定為β-D構(gòu)型。5c試驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]相符,糖甙鍵為α-L構(gòu)型。另推測5e為β-L構(gòu)型。

2.2 體外抗腫瘤活性

MTT法： 5a～5e用DMSO溶解后，加入PBS(-)配成1000 μg·mL-1的溶液或均勻的混懸液，然后用含DMSO的PBS(-)稀釋。

在96孔板每孔加入4～5×104個/mL的細(xì)胞懸液100 μL，置37 ℃， 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h后加入樣品液，10 μL/孔，設(shè)雙復(fù)孔，37 ℃， 5%CO2作用72 h。每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，作用4 h后加入溶解液，100 μL/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)，溶解后用MK-2全自動酶標(biāo)儀測570 nm處的OD值，計算IC50,結(jié)果見表1。從表1可見，5a～5e具有溫和的體外抑制活性,其中5d具有廣譜優(yōu)勢的活性。從表1還可見，5a～5e對MAD-MD-435,231, QGY7703和HL-60三種腫瘤細(xì)胞有較好的選擇性抑制活性;solasodine 3-位羥基上引入非天然的苯甲酰氨基葡萄糖可有效增強(qiáng)solasodine的抗腫瘤活性,對5d的進(jìn)一步修飾以發(fā)現(xiàn)廣譜更有效的抗腫瘤化合物的工作正在進(jìn)行,待后續(xù)報道。

表15a～5e的體外抗腫瘤活性*
Table1In vitro antitumor activities of 5a～5e

CompIC50/μg·mL-1ABCDE5a>20>2012.3811.2513.395b>20>20>20>20>205c12.27>207.6911.2211.655d9.9411.555.60(231)13.355.035e>20>2016.19>20>20阿霉素0.1330.0610.0460.0160.001

*4的IC50>20 μg·mL-1； A： A549； B： QGY7703； C： HL-60； D： Colo205； E： MDA-MD-435,231

[1] 周宜強(qiáng). 實(shí)用中醫(yī)腫瘤學(xué)[M].中醫(yī)古籍出版社,2005：191-192.

[2] Daunter B, Cham B E. Solasodine glycosides,in vitro preferential cytotoxicity for human cancer cells[J].Cancer Letter,1990,55(3):209-220.

[3] Cham B E, Daunter B. Solasodine glycosides,selective cytotoxicity for cancer cells and inhibition of cytotoxicity by rhamnose in mice with sarcoma 180[J].Cancer Letter,1990,55(3):221-225.

[4] Nakamura T, Komori C, Lee Y Y,etal. Cytotoxic activities of solanum sterosidal glycosides[J].Bio Pharm Bull,1996,19(4):564-566.

[5] Ikeda T, Tsumagari H, Honbu T,etal. Cytotoxic activities of sterosidal glycosides from solanum plants[J].Bio Pharm Bull,2003,26(8):1198-1201.

[6] 劉良,劉芯辰,崔淑華. 澳洲茄胺的制備方法及其澳洲茄胺在醫(yī)藥上的應(yīng)用[P].CN 1 552 724，2004.

[7] 陳磊,查曉明,江振洲，等. 甾體生物堿澳洲茄胺的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展,2011,25(6):257-265.

[8] Shahid, Mohammed. Synthesis of solanum glycosides[P].WO 03 018 604，2003.

[9] Wei G H, Wang J, Du Y G. Total synthesis of solamargine[J].Bioorg & Medicine Chemistry Letter，2011,21：2930-2933.

[10] Zhang G P, Shen S D, Lei M,etal. A facile and efficient method for he synthesis of solasodine from diosgenin[J].Tetrahedron,2011,67：5894-5896.

[11] Lou H X, Gao J, Wang Y Y,etal. Solasodine-3-o-α-L-rhamnosides,its preparation and application[P].CN 101 974 007,2010.

[12] Pellissier H. The glycosylation of steroids[J].Tetrahedron,2004,60:5123-5162.

[13] 裴月湖,華會明,李占林,等. 核磁共振法在苷鍵構(gòu)型確定中的應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報,2011,46(2):127-131.