王 旺 王 靜 孫肖紅 楊 宇 張曉龍 趙婷婷 曹曉梅

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢疫研究所, 北京 100123)

蚊媒病毒是一類重要的傳染病病原體，包括多種病毒，其中很多造成過世界范圍內(nèi)的傳染病大流行(詹希美, 2001)。近年來，隨著全球氣候逐漸上升、城市化進(jìn)程的加快、旅游和貿(mào)易的快速發(fā)展、生態(tài)環(huán)境的不斷變化，全球蚊媒傳染病發(fā)病呈上升趨勢(shì)，原有疾病的流行區(qū)域不斷擴(kuò)展、疾病的流行頻度不斷增加，有日益蔓延的趨勢(shì)(Slenning, 2010)。因此開發(fā)針對(duì)蚊媒病毒特異、敏感且快速的檢測(cè)方法對(duì)相應(yīng)疾病的的預(yù)防、治療以及流行的有效控制均具有重要意義。懸浮芯片(Suspension array)也稱液相芯片(Liquid array, Liquid chip)，是一種非常靈活的多功能技術(shù)平臺(tái)，可以進(jìn)行蛋白、核酸等生物大分子檢測(cè)、受體和配體識(shí)別分析等研究。懸浮芯片主要通過可偶聯(lián)探針的熒光編碼微球與兩束激光檢測(cè)，對(duì)被測(cè)物的定性和定量分析，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的多重檢測(cè)(Dunbar, 2006)。本研究利用懸浮芯片系統(tǒng)為平臺(tái)，針對(duì)十二種重要的蚊媒病毒，建立了一種能檢測(cè)蚊子所攜帶的一種或多種病毒的迅速、準(zhǔn)確而可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株及樣品: 分別包含東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus，EEEV)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus，WEEV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV)、基孔肯亞病毒(Chikungunya virus，CHIK)、登革病毒(Dengue virus，DEN)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、黃熱病毒(Yellow fever virus，YF)、西尼羅病毒(West Nile virus，WN)、圣路易斯腦炎病毒(St. louis encephalitis virus，SLEV)、版納病毒(Banna virus，BAV)、布尼亞病毒(Bunyavirus，BUN)、裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVF)12種病毒檢測(cè)靶標(biāo)基因的菌株，由北京華大基因公司合成基因片段后，轉(zhuǎn)化至JM109菌株?，F(xiàn)場(chǎng)樣品來自2009年在中國云南邊境地區(qū)的人房和畜圈采集的蚊蟲標(biāo)本。陰性蚊蟲標(biāo)本由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局醫(yī)學(xué)媒介中心提供。

1.1.2主要試劑及儀器：酶及緩沖液(TaKaRa，大連)；DNA-marker(Takara，大連)；膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒(QIAGEN，Germany)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PROMEGA，USA)；MicroPlex-TAG Beads(Luminex，USA)；藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素 (Streptavidin-R-phycoerythrin, SA-PE) Invitrogen公司SA-PE(Invitrogen，USA)；96孔酶標(biāo)板(Nunc，USA)；Bioplex 100液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-rad，USA)。

1.1.3引物設(shè)計(jì)與合成：通過DNAstar軟件分別對(duì)每個(gè)屬的基因進(jìn)行序列比對(duì)和保守序列分析。用PrimerPlex軟件設(shè)計(jì)特異性引物。每條上游引物5′端添加特異的 anti-TAG 序列(與Luminex公司提供x-TAG 磁性微球上的 TAG 序列反向互補(bǔ))，引物與TAG之間連接C9作為加臂，下游引物5′端用生物素修飾。PCR引物均由生工生物工程(上海) 有限公司合成(表1)。

表1 所用的12種蚊媒病毒的擴(kuò)增引物Tab.1 Designed primers of the 12 species mosquito-borne virus for multi-PCR

注：EEEV: 東方馬腦炎病毒 Eastern equine encephalitis virus; WEEV: 西方馬腦炎病毒W(wǎng)estern equine encephalitis virus; VEEV: 委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒 Venezuelan equine encephalitis virus; CHIK: 基孔肯亞病毒 Chikungunya virus; DEN: 登革病毒Dengue virus; JEV: 日本腦炎病毒 Japanese encephalitis virus; YF: 黃熱病毒Yellow fever virus; WN: 西尼羅病毒 West nile virus; SLEV: 圣路易斯腦炎病毒 St. louis encephalitis virus; BAV: 版納病毒 Banna virus; BUN: 布尼亞病毒 Bunyavirus; RVF: 裂谷熱病毒 Rift valley fever virus。下同。The same below.

*斜體為anti-TAG 序列(與x-TAG磁性微球上的TAG序列反向互補(bǔ))。Italics represents anti-TAG sequences(reverse complementary sequence of the TAG on the x-TAG magnetic microspheres).

1.2 方法

1.2.1菌株質(zhì)粒提取: 將帶有陽性克隆的工程菌用質(zhì)粒微量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，操作方法按說明書進(jìn)行，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測(cè)提取質(zhì)粒。通過超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得各質(zhì)粒濃度，并將其稀釋到10 ng/μL備用。

1.2.2引物特異性驗(yàn)證: 將合成好的引物按說明溶解后，分別按如下配置PCR反應(yīng)體系，12對(duì)引物對(duì)應(yīng)的12種不同反應(yīng)體系中對(duì)應(yīng)加入已提取并稀釋的DNA模板。PCR體系：10 × PCR buffer 3 μL；Taq HS 0.3 μL；dNTPs 4 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；DNA 2 μL；雙蒸水補(bǔ)足30 μL。反應(yīng)條件是：94℃預(yù)變性10 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

PCR陰性對(duì)照：除不加模板而以雙蒸水代替外，其余體系相同。反應(yīng)結(jié)束后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增情況。

1.2.3多重PCR體系及條件優(yōu)化: 將12種待檢病毒按種屬分為3組，第1組為東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、基孔肯亞病毒；第2組為黃熱病毒、西尼羅腦炎病毒、登革病毒、乙型腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒；第3組為版納病毒、布尼亞病毒、裂谷熱病毒。并結(jié)合后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)多重PCR的退火溫度以及體系中加入引物量進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4雜交及雜交條件的優(yōu)化: 取每種帶有anti-TAG標(biāo)簽的微球各3 500個(gè)加入到雜交液中，使其總量為35 μL；向各管中加10 μL蚊媒病毒的PCR產(chǎn)物吹打混勻；向各孔加4 ng/μL SA-PE的1×TMAC液(全稱)，使之總體積變?yōu)?0 μL，37℃下雜交一定時(shí)間；轉(zhuǎn)移至磁力板上洗掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物再向各孔加入80 μL 1× TE溶液，振蕩使微球重懸；用Bio-Plex 100 system進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)合的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。雜交條件的優(yōu)化：分別對(duì)雜交溫度、雜交時(shí)間和PCR產(chǎn)物加入量進(jìn)行優(yōu)化。雜交溫度分別選擇35℃、37℃、40℃、42℃、45℃ 5個(gè)溫度進(jìn)行，其他步驟照上述進(jìn)行，保持不變，以MFI進(jìn)行結(jié)果判斷。確定雜交溫度后，雜交時(shí)間分別取15、20、25、30 min，進(jìn)行雜交時(shí)間的優(yōu)化。

1.2.5檢測(cè)體系特異性實(shí)驗(yàn): 體系內(nèi)特異性：將十二種病毒中每一種模板分別用其他11種檢測(cè)引物擴(kuò)增并雜交，上機(jī)檢測(cè)MFI(mean fluorescence intensity)值，考核系統(tǒng)內(nèi)對(duì)樣品檢測(cè)的特異性。

體系外特異性：選取了墨累谷腦炎、瘧原蟲、森林腦炎病毒、流行性出血熱病毒作為對(duì)照，驗(yàn)證本檢測(cè)方法的特異性。

1.2.6檢測(cè)體系靈敏度實(shí)驗(yàn): 待檢目標(biāo)核酸系列稀釋，設(shè)10個(gè)稀釋度，最優(yōu)條件下進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，用Bio-Plex Version 4.0分析系統(tǒng)得到檢測(cè)體系的方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)得出檢測(cè)體系的檢測(cè)下限。

1.2.7實(shí)際樣品檢測(cè)試驗(yàn):從液氮中取出凍存蚊蟲標(biāo)本，研磨后取上清140 μL用試劑盒提取RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA用本方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 退火溫度優(yōu)化

按基本PCR體系，退火溫度選擇52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，分別對(duì)3組待檢病毒進(jìn)行擴(kuò)增，并同時(shí)設(shè)置PCR陰性對(duì)照，擴(kuò)增結(jié)果用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查，結(jié)果證明56℃時(shí)3組中大部分病毒檢測(cè)的MFI值均高于其他溫度，因此選用56℃為退火溫度。

2.2 引物對(duì)濃度優(yōu)化

根據(jù)基本PCR體系對(duì)體系內(nèi)各靶標(biāo)的擴(kuò)增情況，對(duì)3組PCR反應(yīng)體系中12種引物的濃度進(jìn)行調(diào)整，確保各組PCR產(chǎn)物在多重PCR體系中均能有效擴(kuò)增擴(kuò)增量接近，經(jīng)調(diào)整后各組引物加入量(10 μmmol/L)見表2。

表2 多重PCR體系中優(yōu)化的引物對(duì)加入量Tab.2 Optimized quantity of the primers in multi-PCR

2.3 雜交以及雜交條件的優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)過程條件優(yōu)化完畢后，對(duì)雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化，確保PCR產(chǎn)物經(jīng)過雜交過程能夠更好的與微球結(jié)合，從而得到更高的檢測(cè)值。

2.3.1雜交溫度的優(yōu)化：雜交溫度分別選擇35℃、37℃、40℃、42℃、45℃ 5個(gè)溫度進(jìn)行，以信號(hào)熒光值MFI的高低作為條件優(yōu)化的依據(jù)，結(jié)果如圖1所示，在42℃時(shí)大部分病毒檢測(cè)時(shí)得到的MFI值最高，因此選用雜交溫度為42℃。

2.3.2雜交時(shí)間的優(yōu)化：確定雜交溫度后，雜交時(shí)間分別取15、20、25、30 min，同上一部分進(jìn)行雜交時(shí)間的優(yōu)化。結(jié)果如圖2所示，在雜交進(jìn)行到25和30 min時(shí)所得到的MFI相近，并且12種病毒的檢測(cè)值普遍高于15和20 min，考慮到實(shí)驗(yàn)快捷性，選用雜交時(shí)間為25 min。

圖1 雜交溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimized hybridization tempreture

圖2 雜交時(shí)間優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimized hybridization duration

2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

測(cè)定含待測(cè)病毒靶標(biāo)的12種質(zhì)粒濃度，分別進(jìn)行系列稀釋，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行檢測(cè)，Bio-Plex Version 4.0分析，得出劑量-反應(yīng)曲線(圖3)并根據(jù)方程算出檢測(cè)下限。經(jīng)計(jì)算，12種病毒檢測(cè)下限如表4所示。

圖3 雜交檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of hybridization detection

Ⅰ組Ⅰ GroupⅡ組Ⅱ GroupⅢ組Ⅲ Group檢測(cè)病毒Virus檢測(cè)下限Lower limit of detection檢測(cè)病毒Virus檢測(cè)下限Lower limit of detection檢測(cè)病毒Virus檢測(cè)下限Lower limit of detectionEEEV0.008YF0.611 BUN8.571 WEEV2.261 WN7.073 Ban156.251 VEEV2.408 JEV0.145RVF9.752 CHIK10.012 DEN1.729SLEV9.697

2.5 特異性檢測(cè)

體系內(nèi)交叉檢測(cè)所得熒光值接近空白值，說明均與組內(nèi)其他病毒間不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性好，結(jié)果如圖4所示。

圖4 檢測(cè)特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Evaluated result of the specific test

對(duì)墨累谷腦炎、瘧原蟲、森林腦炎病毒、流行性出血熱病毒的基因組進(jìn)行檢測(cè)，熒光值均和空白值相當(dāng)，表明僅與目標(biāo)病毒進(jìn)行反應(yīng)，與其他蟲媒病原體無交叉。

2.6 實(shí)際蚊蟲樣本檢測(cè)

共研磨91份蚊蟲樣本，白紋伊蚊58只，淡色庫蚊14只，三帶喙庫蚊6只，中華按蚊13只。其中2只淡色庫蚊和7只白紋伊蚊檢出乙腦病毒，其他未檢出，與實(shí)驗(yàn)室用熒光定量PCR結(jié)果一致(郭金金等，2012)，初步證明本研究建立的方法可靠，可以很好的用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 討論

蚊媒病毒主要通過蚊蟲叮咬在人群中傳播，傳播速度快、危害大，并且隨著氣候及環(huán)境的變化，有日益蔓延的趨勢(shì)(Slenning, 2010)。我國南方地區(qū)氣候潮濕、炎熱，適合多種蚊媒病毒的繁殖，且傳播媒介種類繁多，其中，許多蚊媒病毒的致病性、臨床癥狀和流行季節(jié)均十分相似并存在嚴(yán)重的血清學(xué)交叉反應(yīng)(Sahetal., 2009)，因此建立特異敏感的檢測(cè)手段對(duì)該類疾病的預(yù)防治療與控制具有重要意義，建立復(fù)合檢測(cè)方法對(duì)于蚊媒病毒的監(jiān)測(cè)具有積極意義。

病毒的診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)、電子顯微鏡技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)等。病毒分離法和血清學(xué)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)繁瑣，達(dá)不到早期快速診斷的目的，免疫學(xué)方法進(jìn)一步提高了靈敏度和特異性，但檢測(cè)結(jié)果也與其他的病毒存在著一定程度的交叉反應(yīng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，一些新型檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生。懸浮芯片是近年來興起的一種檢測(cè)技術(shù),與常規(guī)的病原分離鑒定、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝和血凝抑制試驗(yàn)、免疫熒光法和ELISA等實(shí)驗(yàn)方法相比,它具有高通量、操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn),特別適合于多病原體的高通量檢測(cè)及鑒定，并已廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測(cè)中(Iannoneetal., 2001; Liuetal., 2011; Pabbarajuetal., 2011)。

目前懸浮芯片方法中雜交所采用的主要為直接雜交法，即在檢測(cè)片段上選取一段序列作為探針，檢測(cè)前需要預(yù)先用氨基化探針對(duì)微球進(jìn)行包被(羅淵, 2008)，步驟繁瑣不易操作，并且多重檢測(cè)中，由于多重探針的存在，雜交溫度的選擇也是一個(gè)技術(shù)開發(fā)時(shí)的瓶頸(Tayloretal., 2001)。x-TAG技術(shù)解決了這一問題，TAG 與anti-TAG 是基于結(jié)核分枝桿菌M.tuberculosis的序列設(shè)計(jì)而成，不含有堿基G，TAG與anti-TAG 精確互補(bǔ)、雜交溫度恒為37℃，但這種方法雜交前需要用帶有TAG序列的探針對(duì)第一步的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TSPE(target-specific primer extension)，以得到帶有TAG序列的單鏈片段，解決雜交溫度統(tǒng)一性的同時(shí)也帶來了耗時(shí)長，步驟繁瑣的問題(Janseetal., 2012)。本研究結(jié)合前兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，將TAG直接合成至引物上，從而在PCR擴(kuò)增中直接將TAG序列引入擴(kuò)增產(chǎn)物，減少了實(shí)驗(yàn)操作，同時(shí)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并且節(jié)省了實(shí)驗(yàn)所需試劑及耗材。

本實(shí)驗(yàn)建立的懸浮芯片檢測(cè)方法經(jīng)與實(shí)時(shí)定量PCR比對(duì)，對(duì)蚊蟲樣品的檢測(cè)結(jié)果完全一致，并且有很好的特異性。并且由于雜交條件的同一性，所以在臨床使用時(shí)，完全可以根據(jù)樣本的不同特點(diǎn)，從中選擇特殊組合的微球，臨時(shí)搭配所需要的檢測(cè)體系。該懸浮芯片檢測(cè)方法的建立，不僅有利于積極開展新發(fā)傳染病的監(jiān)測(cè)、檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制的研究，還可以有效預(yù)防和控制傳染病的發(fā)生和傳播，為傳染病的流行趨勢(shì)提供預(yù)測(cè)預(yù)警信息，具有廣闊的應(yīng)用前景。