杜幼芹 劉 英 汪鋆植 馮天艷 鄧改改 龔 權(quán)

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，湖北宜昌 443002；2.天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 三峽大學(xué)，湖北宜昌 443002；3.長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

血吸蟲(chóng)性肝纖維化是血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原引起的，以肝蟲(chóng)卵肉芽腫和肝纖維化為特點(diǎn)的免疫性疾病(Boros,1989)。研究表明，吡喹酮治療后未成熟蟲(chóng)卵仍可繼續(xù)發(fā)育，蟲(chóng)卵肉芽腫反應(yīng)仍在繼續(xù)，而且一旦肝纖維化達(dá)到一定程度，即使去除誘因，肝纖維化仍將繼續(xù)(Robertsetal., 1993; Gryseelsetal.,2006)。因此，在蟲(chóng)卵肉芽腫形成階段和肝纖維化早期如何用藥物干預(yù)、控制其發(fā)展，成為吡喹酮治療后控制血吸蟲(chóng)性肝病發(fā)展的關(guān)鍵。然而，至今尚無(wú)高效低毒藥物用于血吸蟲(chóng)性肝病的治療。

根皮苷(Phloridzin)是根皮素 (Phloretin)的 2′-β-D-葡萄糖屬于植物黃酮類(lèi)中的二氫查爾酮苷，存在于蘋(píng)果屬多種植物中，在根、莖、葉和果實(shí)中均有分布。與其他黃酮類(lèi)相比，二氫查爾酮苷在自然界存在很少，被稱(chēng)為“少數(shù)黃酮類(lèi)”(Christianetal.,2010)。根皮苷具有多種生物活性，如降血糖(Masumotoetal.,2009)、 平衡雌激素(Wangetal.,2010)、抗氧化、保護(hù)心臟、并對(duì)急性肝損傷有保護(hù)作用(Amoletal.,2009；Vasantha Rupasingheetal.,2010；馮天艷等, 2010；)等,且還具有低毒(屈克義等,2010)的特點(diǎn), 這使它在很多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。本課題以日本血吸蟲(chóng)Schistosomajaponicum感染小鼠作為肝纖維化模型,觀(guān)察根皮苷對(duì)小鼠肝纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物及試劑：根皮苷:天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (三峽大學(xué))提供, 從湖北海棠中提取分離得到,純度為 98%。由天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué))提供。復(fù)方鱉甲軟肝片，內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司，批號(hào)：20090625。吡喹酮片，南京制藥廠(chǎng)有限公司，批號(hào)：20090704。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、羥脯氨酸(HYP)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，小鼠血清透明質(zhì)酸(HA)ELISA試劑盒為上海研吉生物科技有限公司提供的美國(guó)R&D systems產(chǎn)品，其他試劑皆為分析純。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及釘螺: 6～8周齡清潔級(jí)昆明小鼠40只， 雌、雄各半，體重(20±2)g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(鄂)2009-0007；將動(dòng)物置于室溫25℃環(huán)境下，飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)，自由飲水，以全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)。感染中國(guó)大陸株日本血吸蟲(chóng)尾蚴的陽(yáng)性釘螺購(gòu)自江西省寄生蟲(chóng)病防治研究所。

1.2 方法

1.2.1感染及分組：按常規(guī)將釘螺放入去氯離子自來(lái)水中逸出尾蚴，小鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴40～50條/只，然后隨機(jī)將未感染和感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴昆明小鼠分成4組A～D，未感染空白對(duì)照組(A)、模型組(B)、復(fù)方鱉甲軟肝片組(C)、根皮苷組(D)，每組10只。于感染后第42 d，B、C、D組均給予吡喹酮灌胃治療，500 mg/(kg·d) 2日療法，A組以生理鹽水灌胃對(duì)照。吡喹酮灌胃治療后，C組給予灌胃復(fù)方鱉甲軟肝片1 000 mg/(kg·d)×60 d，D組灌胃根皮苷40 mg/(kg·d)×60 d，A和B組均以生理鹽水灌胃作對(duì)照。

1.2.2血清樣品收集與檢測(cè)：末次給藥后，禁食不禁水過(guò)夜，24 h后摘眼球取血，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALT和AST水平，ELISA法檢測(cè)血清中HA含量，具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3肝組織樣品處理：取小鼠肝臟，用4℃預(yù)冷生理鹽水沖盡表面浮血，濾紙拭干、稱(chēng)重，按肝體指數(shù)=(肝臟重量(g)/體重(g))×100%公式計(jì)算小鼠肝體指數(shù)，然后取小鼠肝臟右葉同一部位切成4 mm薄片，4%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作厚4μm 連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀(guān)察肝組織中蟲(chóng)卵肉芽腫的大??；膠原纖維染色(Masson染色)，光鏡觀(guān)察膠原沉積情況，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算膠原纖維面積。每只小鼠做1張切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中藍(lán)色膠原分布的面積，其和為該切片纖維化面積，用于判斷肝纖維化程度；另取肝組織0.1 g測(cè)定其HYP含量，操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清HA、ALT、AST含量

與A組相比，B和C、D組血清中HA、ALT、AST含量均升高，其中B組最高。而C、D組與B組相比，均能顯著降低血清中ALT、AST、HA含量(P<0.05或P<0.01)(表1)。

表1 根皮苷對(duì)肝纖維化小鼠血清HA、ALT、AST的影響Tab.1 Effects of phloridzin on the level of HA, ALT and AST in serum of hepatic fibrosis mice

注：與模型比,*P<0.05，**P<0.01。

Note:*P<0.05 compared with the model group B,**P<0.01 compared with the model group B.

2.2 肝組織中HYP含量

A組中HYP含量極低，模型組B和各治療組C、D肝組織中HYP含量均明顯升高，其中模型組最高。而C、D組與模型組B相比，根皮苷和鱉甲軟肝片均能顯著降低肝組織中HYP含量(P<0.05或P<0.01)，也能明顯降低小鼠的肝體指數(shù)(P<0.05或P<0.01)(表2)。

表2 根皮苷對(duì)肝纖維化小鼠肝體指數(shù)、肝HYP、肝膠原面積的影響Tab.2 Effects of phloridzin on hepaticsomatic indices, HYP and collagen area of the liver of hepatic fibrosis mice

注：*表示與模型比P<0.05，**表示P<0.01.

Note:*P<0.05 compared with the model group B,**P<0.01 compared with the model group B.

2.3 肝臟組織病理變化

A組小鼠肝臟表面光滑，紅褐色，HE染色鏡下見(jiàn)肝細(xì)胞沿肝小葉呈放射狀分布，Masson染色未見(jiàn)藍(lán)色膠原沉積。B組小鼠肝臟明顯增大，表面布滿(mǎn)大小不一的灰白色顆粒，鏡下見(jiàn)大量蟲(chóng)卵肉芽腫，匯管區(qū)及蟲(chóng)卵肉芽腫周?chē)w維增生明顯，大部分蟲(chóng)卵肉芽腫出現(xiàn)壞死病灶及纖維化，肝血竇擴(kuò)張充血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，蟲(chóng)卵肉芽腫周?chē)约皡R管區(qū)大量藍(lán)色膠原沉積。C、D組小鼠肝臟輕微增大，質(zhì)地中等，表面灰白色結(jié)節(jié)明顯少于B組，鏡下蟲(chóng)卵肉芽腫面積和數(shù)量明顯減小，藍(lán)色膠原面積明顯低于B組，肝纖維化程度明顯降低(表1、2; 圖1)。

圖1 根皮苷對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝纖維化的影響Fig.1 Effects of phloridzin on hepatic fibrosis caused by Schistosoma japonicum infectionA～D: Masson染色(×100); E～H: HE染色(×100). A, E：空白組; B, F：模型組; C, G：復(fù)方鱉甲軟肝片; D,H：根皮苷.A-D: Masson staining (×100); E-H: HE staining (×100). A, E: Blank group; B, F: Model group; C, G: Complex liver soften tablet of turtle; D, H: Phloridzin.

3 討論

肝纖維化是纖維增生和分解不平衡導(dǎo)致肝纖維組織過(guò)度沉積的結(jié)果。反復(fù)或持續(xù)的肝損傷或炎性病變，可使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 合成過(guò)多而降解相對(duì)不足，從而形成肝纖維化。肝星狀細(xì)胞(HSC)目前被公認(rèn)是ECM的主要來(lái)源細(xì)胞，HSC的激活是肝纖維化形成的初始中心環(huán)節(jié)(Friedmanetal.,2004)。血清HA是反映肝細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)代謝的血清學(xué)指標(biāo)，與肝纖維化程度有明顯相關(guān)性。HA為糖胺多糖類(lèi)物質(zhì)，在肝內(nèi)由HSC合成并釋放入血液循環(huán)中，而肝細(xì)胞可清除和降低循環(huán)血液中HA。肝纖維化時(shí)，由于HSC的增殖和激活以及肝細(xì)胞的功能下降，致使HA不但合成增加，而且清除下降。所以，HA是反映肝纖維化的敏感指標(biāo)，也可反應(yīng)肝纖維化程度(Kopke-Aguiaretal.,2002；Massartetal.,2006)。

近來(lái)的研究顯示很多中藥材中的總黃酮對(duì)慢性肝炎、肝纖維化、急慢性肝損傷等有很好的保護(hù)作用(陳飛虎等,2007；吳繁榮等,2008；丘志春等,2010)。我們前期的研究顯示，湖北海棠總黃酮對(duì)日本血吸蟲(chóng)性肝纖維化有很好的抑制作用(杜幼芹等,2011)，而根皮苷是總黃酮的主要成分，本實(shí)驗(yàn)采用的根皮苷是從湖北海棠葉總黃酮提取的，治療小鼠血吸蟲(chóng)性肝纖維化的結(jié)果顯示根皮苷能明顯改善日本血吸蟲(chóng)感染引起的肝臟病理變化，減小肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫面積，降低肝臟組織中HYP含量，減少膠原纖維在肝臟組織中沉積，且降低血清中ALT、AST、HA的水平，對(duì)小鼠血吸蟲(chóng)性肝纖維化有確切的治療效果。說(shuō)明總黃酮中對(duì)小鼠肝纖維化發(fā)揮抑制作用的就是根皮苷，根皮苷在改善肝纖維化中的作用與復(fù)方鱉甲軟肝片相比效果相同，其作用機(jī)制可能與降低血清中HA酶的含量有關(guān)。

本研究提示，根皮苷可以作為吡喹酮治療血吸蟲(chóng)病的輔助用藥，用吡喹酮有效殺蟲(chóng)治療的同時(shí)，如能盡早服用根皮苷，有可能改善血吸蟲(chóng)病患者肝纖維化的預(yù)后。