王振生 王小梅 竇相峰 李 旭任海林 劉 娟 卜玲毅 王 恒**

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病原生物學(xué)系，北京 100005；2. 北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013)

巴貝西蟲是經(jīng)過蜱媒傳播的人獸共患寄生原蟲，有近100種巴貝西蟲在野生或家養(yǎng)動(dòng)物種群中廣泛傳播，主要侵染牛、馬、羊、犬以及鼠等哺乳動(dòng)物，哺乳動(dòng)物宿主感染巴貝西蟲后會(huì)造成體溫升高、溶血性貧血、血紅蛋白尿，嚴(yán)重感染病例可造成死亡。巴貝西蟲病流行呈世界性，流行范圍較廣的主要包括分布在歐洲各國的分歧巴貝西蟲Babesiadivergens和分布在北美洲的田鼠巴貝西蟲，前者以牛為重要保蟲宿主，流行面積最廣，對(duì)畜牧業(yè)危害嚴(yán)重，后者以感染野棲鼠為主(Vannieretal., 2012)。除此之外還有牛巴貝西蟲B.bovis、犬巴貝西蟲B.canis及馬巴貝西蟲B.equi的局部流行。在我國，巴貝西蟲感染分布廣泛，近年來在新疆(簡(jiǎn)子健等, 2011)、青海(馬利青等, 2012)、浙江(姜理平等, 2012)、云南等多個(gè)省份的哺乳動(dòng)物體內(nèi)都檢測(cè)到巴貝西蟲病原體。分歧巴貝西蟲和田鼠巴貝西蟲均可感染人體，主要是通過蜱媒叮咬(Kjemtrupetal., 2000; Walsh, 2013)或輸血感染(Saito-Itoetal., 2000; Kimetal., 2007)，患者臨床癥狀輕重各異，根據(jù)個(gè)體的免疫功能強(qiáng)弱，其蟲血癥有較大范圍的波動(dòng)。近年來在我國人體感染巴貝西蟲病例逐漸增多(王惠萱, 2012; 姚立農(nóng)等, 2012)。野棲鼠是田鼠巴貝西蟲重要的保蟲宿主，其感染狀況在一定程度上反應(yīng)了蜱媒分布情況及巴貝西蟲病在野生動(dòng)物宿主種群內(nèi)的流行狀況。北京周邊地區(qū)是野棲鼠及蜱媒分布的重要區(qū)域(李建民等，2002;呂燕寧等，2011)，但其所傳播病原體分布及流行情況缺乏文獻(xiàn)資料。本文就北京市密云縣轄區(qū)野棲鼠巴貝西蟲感染狀況進(jìn)行初步檢測(cè)及蟲種分析，為進(jìn)一步大規(guī)模篩查該蟲在北京周邊地區(qū)流行情況提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料和方法

1.1 野棲鼠捕捉及組織DNA提取

2012年6月于北京市密云縣轄區(qū)坡地通過夾夜法對(duì)野棲鼠進(jìn)行捕捉，使用中型鼠夾，在同一自然生境中布放，每日下午4～6時(shí)成行布放鼠夾，夾距5 m，行距20 m，共布放100只，次晨7～9時(shí)收回，連續(xù)布放3日，捕捉的鼠生物學(xué)分類后，無菌采集心、肺臟組織液氮保存，同時(shí)心臟取血制作薄血涂片。采用基因組提取試劑盒(上海生工，上海)進(jìn)行基因組DNA樣本提取。

1.2 吉姆薩染色及鏡檢

薄血涂片樣本作好標(biāo)注并自然晾干后，加甲醇固定1 min，再次晾干后于血液樣本表面覆蓋吉姆薩染色液染色30 min，清水沖掉染液，晾干后100×油鏡下觀察。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

根據(jù)Armstrong (1998)等人的報(bào)道，針對(duì)田鼠巴貝西蟲核糖體小亞基編碼基因的特異性片段設(shè)計(jì)上下游PCR引物，P1 5′-AATACCCAATCCTGACACAGGG-3′， P2 5′-TTAAATACGAATGCCCCCAAC-3′，PCR反應(yīng)體系：50 μL，分別為10×buffer 5 μL，2.5 mol/L dNTP MIX 2 μL，2 mol/L MgSO4溶液 2 μL，Taq聚合酶 1.5 μL (寶生物，大連)，上下游引物P1、P2各1 μL， 模板3 μL，加雙蒸水補(bǔ)齊至50 μL體系。 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。使用ATCC來源的田鼠巴貝西蟲Peabody mjr株作為陽性對(duì)照，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，1 μg/mL溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染色5 min并在312 nm紫外光下觀察條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切取產(chǎn)物條帶后使用凝膠回收試劑盒(上海生工，上海)進(jìn)行純化回收，將純化片段送上海生工生物公司用其上游引物P1進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.4 DNA序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

將測(cè)序獲得的序列信息提交到NCBI 核酸序列數(shù)據(jù)庫，同時(shí)使用在線BLAST工具進(jìn)行核酸序列比對(duì)，批量獲得高度同源性序列，選取中國及周邊國家采集并提交的田鼠巴貝西蟲蟲株序列及其他巴貝西蟲蟲種序列作為參考數(shù)據(jù)，采用鄰位法(Neighber-Joining method)構(gòu)建進(jìn)化樹。序列分析使用DNAMAN version7.0軟件，構(gòu)建進(jìn)化樹使用Mega5.2軟件，其中bootstraps值為1 000。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢巴貝西蟲病原體

將15只野棲鼠從20～34進(jìn)行編號(hào)并生物學(xué)分類，其中社鼠6只，黑線姬鼠Apodemusagrarius6只，小家鼠Musmusculus3只，相應(yīng)薄血涂片在油鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)23號(hào)社鼠血涂片可見疑似巴貝西蟲感染。鏡下可見蟲體藍(lán)染，位于紅細(xì)胞內(nèi)，呈圓形或橢圓形，直徑在2～3 μm之間，中心有空泡不染色，胞質(zhì)未見瘧色素樣顆粒，感染率為1.85%(圖1)，鏡下未見巴貝西蟲典型的馬耳他十字樣形態(tài)。

圖1 23號(hào)鼠薄血涂片(吉姆薩染色，×1 000)(箭頭標(biāo)注為巴貝西蟲感染紅細(xì)胞)Fig.1 Thin blood smear of No.23 rodent (Giemsa’s stain,×1000)(Arrows indicate the Babesia infected erythrocytes)

圖2 PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)23號(hào)鼠心、肺樣本內(nèi)巴貝西蟲特異DNA片段Fig.2 PCR test detects the specific segments of Babesia parasite genome in samples of heart and lung tissues from No.23 rodent1：陰性對(duì)照；2：田鼠巴貝西蟲Peabody mjr株陽性對(duì)照；3：DNA分子標(biāo)志物；4：心組織樣本；5：肺組織樣本。1: Negative control; 2: Positive control for Babesia microti Peabody mjr strain; 3: DNA molecular markers; 4: Sample of No.23 rodent’s heart; 5: Sample of No.23 rodent’s lungs.

圖3 基于鄰位法構(gòu)建的巴貝西蟲核糖體小亞基特異片段進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of specific segment of ribosomal small subunit based on Neighbor-Joining method449-S：田鼠巴貝西蟲中國浙江株B. microti strain isolated in Zhejiang Province, China；RcMS201：田鼠巴貝西蟲臺(tái)灣眉山地區(qū)株B. microti strain isolated in Meishan mount of Taiwan Province, China；Kobe524：田鼠巴貝西蟲日本神戶株B. microti strain isolated in Kobe City, Japan；NcHZ509：田鼠巴貝西蟲中國浙江杭州株B. microti strain isolated in Hangzhou City of Zhejiang Province, China；NcTT512：田鼠巴貝西蟲中國浙江天臺(tái)山株B. microti strain isolated in Tiantai mount in Zhejiang Province, China；NcWY504：田鼠巴貝西蟲中國福建武夷山株B. microti strain isolated in Wuyi mount in Fujian Province, China；Yunnan-1：田鼠巴貝西蟲中國云南株B. microti strain isolated in Yunnan Province, China；Est884：田鼠巴貝西蟲愛沙尼亞塔林株B. microti strain isolated in Tallinn City, Estonia；FB：田鼠巴貝西蟲澳大利亞莫道克株B. microti strain isolated in Murdoch university of Australia；Kh-1026：田鼠巴貝西蟲俄羅斯西西伯利亞株B. microti strain isolated in Western Siberia area, Russia；RI：田鼠巴貝西蟲美國株B. microti strain isolated in United States；Spain-1：馬巴貝西蟲西班牙馬德里株B. equi strain isolated in Madrid, Spain；RLB67：犬巴貝西蟲南非株B. canis strain isolated in South Africa；hlj15-5：分歧巴貝西蟲中國黑龍江株B. divergens strain isolated in Heilongjiang Province, China；Nov-lp316：分歧巴貝西蟲俄羅斯西西伯利亞株B. divergens strain isolated in Western Siberia area, Russia；TH-B51：牛巴貝西蟲越南株B. bovis strain isolated in Vietnam。

2.2 PCR鑒定蟲種特異序列

對(duì)23號(hào)鼠的心、肺樣本內(nèi)含有的巴貝西蟲蟲種特異性片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段大小為420 bp，用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傳代的田鼠巴貝西蟲Peabody mjr株作為陽性對(duì)照，瓊脂糖凝膠電泳顯示心肺樣本均能檢測(cè)特異性擴(kuò)增的目的片段(圖2)，提示樣本中存在巴貝西蟲病原體。

2.3 進(jìn)化樹構(gòu)建及蟲種同源性分析

經(jīng)過測(cè)序獲得373 bp有效的蟲種特異序列信息(提交于NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank，序列名稱：Miyun23，序列號(hào)：KF891472)，為了進(jìn)一步明確該巴貝西蟲蟲種的同源性，通過與GenBank公開序列進(jìn)行同源性對(duì)比進(jìn)行分析，顯示該序列與牛巴貝西蟲、犬巴貝西蟲、分歧巴貝西蟲同源性均低于60%，與馬巴貝西蟲的同源性為80.5%，說明該巴貝西蟲種與上述蟲種存在差異。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該序列與來自美國的田鼠巴貝西蟲RI分離株(Cornillotetal., 2012)、俄羅斯Kh-1026分離株(Raretal., 2010)、澳大利亞的FB分離株(Senanayakeetal., 2012)以及愛沙尼亞的Est884分離株(Katarginaetal., 2012)DNA序列同源性達(dá)98%以上，提示該蟲種生物學(xué)分類屬于田鼠巴貝西蟲種，少量堿基序列的差別可能是蟲株之間差別所致，分析發(fā)現(xiàn)該序列與鼠來源的田鼠巴貝西蟲中國浙江NcHZ509株、福建NcWY504株、臺(tái)灣眉山地區(qū)RcMS201株的核酸系列同源性為100%(Saito-Itoetal., 2008)，同時(shí)與日本學(xué)者Saito-Ito等人報(bào)道的臨床感染病例樣本中分離得到神戶Kobe524株的DNA序列同源性也為100%(Saito-Itoetal., 2000)(圖3)，說明此次檢測(cè)到的北京市密云株與上述田鼠巴貝西蟲屬于同一蟲株。序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)該序列與中國云南Yunnan-1分離株同源性接近100%僅存在1個(gè)堿基的差異，提示中國境內(nèi)流行的田鼠巴貝西蟲蟲株雖然同源性很高，但依然存在多樣性。

3 討論

自1957年歐洲報(bào)道世界第一例人體巴貝西蟲病確診病例以來，全世界范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)百例巴貝西蟲感染患者，由于巴貝西蟲感染的自愈特征，實(shí)際感染率更高。我國境內(nèi)巴貝西蟲在哺乳動(dòng)物體內(nèi)感染的情況較為普遍，1944年洪式閭報(bào)道了重慶一例疑似瘧原蟲病例，后被確認(rèn)為是我國巴貝西蟲感染首例記錄(瞿逢伊, 2007)，近年來我國報(bào)告的巴貝西蟲感染病例逐年增多(蘇關(guān)關(guān)等, 2002; 王惠萱, 2012; 姚立農(nóng)等, 2012)，巴貝西蟲臨床感染逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。

鑒別巴貝西蟲感染依賴于有效的檢測(cè)技術(shù)，薄血涂片法及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、高效的特點(diǎn)，成為首選。綜合采用這兩種手段對(duì)巴貝西蟲進(jìn)行檢測(cè)，將取得較好的結(jié)果。鏡下觀察可以有效縮窄病原體的可能范圍，但由于巴貝西蟲的紅細(xì)胞寄生階段與瘧原蟲紅內(nèi)期的環(huán)狀體階段形態(tài)極其相似，所以缺乏經(jīng)驗(yàn)的工作人員往往難以區(qū)分。通過PCR檢測(cè)巴貝西蟲特異性片段能夠有效地彌補(bǔ)薄血涂片檢測(cè)的這一不足，其核糖體小亞基特異編碼片段的擴(kuò)增足以排除瘧原蟲感染的可能。因此兩種檢測(cè)手段的配合使用加大了巴貝西蟲感染檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

北京地理環(huán)境復(fù)雜，處于太行山脈，燕山山脈和華北平原三級(jí)地勢(shì)交接處，客觀提供了蜱媒及巴貝西蟲野棲動(dòng)物宿主賴以生存的地理環(huán)境(陳澤等，2008; 李建民等，2002)，但巴貝西蟲有效傳播的可能性缺乏文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的支持。此次對(duì)北京市密云縣捕獲的15只野棲鼠進(jìn)行了檢測(cè)，其中1只社鼠確定為巴貝西蟲感染陽性，提示北京郊區(qū)可能存在巴貝西蟲的廣泛流行。經(jīng)過序列對(duì)比及同源進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該蟲株核糖體小亞基編碼基因的蟲種特異性序列與中國浙江、福建、臺(tái)灣等地田鼠巴貝西蟲分離株相應(yīng)序列完全一致(Saito-Itoetal., 2008)，日本學(xué)者報(bào)道該蟲株曾造成人體感染(Saito-Itoetal., 2000)。北京地區(qū)人口密集，生產(chǎn)生活節(jié)奏較快，人類活動(dòng)范圍逐年擴(kuò)展，與蜱媒接觸的機(jī)會(huì)不斷增加，北京郊區(qū)田鼠巴貝西蟲的感染可能成為向人群傳播的潛在威脅。本文首次報(bào)道密云縣野棲鼠存在巴貝西蟲感染的情況具有重要流行病學(xué)意義，該數(shù)據(jù)提示有必要針對(duì)北京市周邊田鼠巴貝西蟲流行狀況進(jìn)行深入調(diào)查，加強(qiáng)北京地區(qū)臨床疑似病例的篩查力度，為更科學(xué)地作好這一區(qū)域巴貝西蟲感染的防控工作提供有力的數(shù)據(jù)支持。