喻曉丹

（遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，貴州遵義563002）

造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HPSC）普遍存在于骨髓（bone marrow，BM）、動員的外周血（mobilized peripheral blood，PB）和臍帶血（umbilical cord blood，UCB）等組織中[1-3]。Takahashid等的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的胎盤具有造血功能[4]。近年來的研究表明，人胎盤組織富含造血干細(xì)胞，其CD34+細(xì)胞的百分率為臍帶血的8.8倍[5，6]。AC133為近年來確立的一種新的HPSC特征性膜表面標(biāo)志[7，8]。已有的研究表明，AC133僅表達(dá)于造血組織和有限的幾種低分化腫瘤細(xì)胞株當(dāng)中[9，10]，這不僅說明AC133標(biāo)志比CD34更為原始，由此，有必要對胎盤組織 AC133+細(xì)胞組分的含量及其血細(xì)胞增殖分化能力作出評價。本實驗采用免疫磁性細(xì)胞分選法（magnetic activated cell sorting，MACS）分選人胎盤組織AC133+，并用不同培養(yǎng)體系分別對其進行血細(xì)胞集落形成培養(yǎng)，以評價其增殖分化能力。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Ficoll Histopaque購于 Sigma公司；IMDM、FBS、DES、EPO購于Gibco公司；IL-3、GM-CSF、Methylcellulose購于Intergen公司；AC133Mutisort免疫磁珠細(xì)胞分選試劑盒及 M iniMACS分離柱購于M iltenyi Biotee公司；熒光素標(biāo)記單抗 AC133-PE McAb、M cAb購自BD公司；其余試劑均為分析純。

1.2 胎盤的來源

足月分娩人胎盤，HbsAg-，胎盤于6h內(nèi)進入實驗程序。

1.3 胎盤組織（Placenta tissue， PT）單個核細(xì)胞（MNC）懸液的制備

用PBS清洗胎盤表面血跡，剪去胎膜后，多點全層剪取100g胎盤組織，再用PBS洗凈殘留的血液，將其剪碎，經(jīng)機械分離（不銹鋼網(wǎng)搓）得到胎盤組織單個核細(xì)胞（MNC）懸液，該過程在冰浴中進行。胎盤組織單個核細(xì)胞（MNC）懸液1500 rpm離心5m in，細(xì)胞沉淀用IMDM懸浮，Histopaque分選MNC，鏡下計數(shù) MNC，臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活力（細(xì)胞活力>90%）。

1.4 PT-AC133+和PT-AC133-細(xì)胞亞群的免疫磁性分選

按AC133Mutisort試劑盒說明分選PT AC133+和AC133-細(xì)胞亞群。

1.5 胎盤細(xì)胞樣品的流式細(xì)胞儀（FCM）分析

調(diào)細(xì)胞濃度至1×106/m L，于盛有20L相應(yīng)單抗（AC133-PE、CD34-PE）的試管中加入100L細(xì)胞懸液，混勻，室溫避光靜置20min，1000 rpm離心5m in，棄上清，重新懸浮細(xì)胞。每管加入2m L含0.1%NaN3的PBS，混勻，1000 rpm離心 5 min，棄上清，再懸浮細(xì)胞；每管加入0.5m L1%的多聚甲醛，混勻，2～8oC避光放置，上機分析。采用CellQuest軟件對標(biāo)記樣品進行采集和分析（每管采集2×104個細(xì)胞）。MNC和AC133+細(xì)胞絕對計數(shù)用ProCOUNT軟件采集和分析。AC133+細(xì)胞純度按文獻(xiàn)介紹的公式計算[4]。

1.6 血細(xì)胞集落形成培養(yǎng)

對從胎盤分選的AC133+、AC133-細(xì)胞分別進行CFU-GM、CFU-E、CFU-M ix培養(yǎng)。

1.6.1 CFU-GM培養(yǎng)

用瓊脂培養(yǎng)體系進行CFU-GM培養(yǎng)。采用直徑為35mm塑料平皿，種入1m L培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基為RPM I1640，其中含20%FBS、5000個細(xì)胞、200U 粒細(xì)胞―巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），最后加入40℃保溫的3%瓊脂0.1m L，迅速混勻，靜置冷卻使之凝固，重復(fù)3個皿，37℃，5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)10～14d，觀察CFU-GM形成情況。

1.6.2 CFU-E培養(yǎng)

用甲基纖維素培養(yǎng)體系進行CFU-E培養(yǎng)。采用直徑為35mm塑料平皿，種入1m L培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基為 IMDM，其中含 30%FBS、5000個細(xì)胞、10%0.1m L、10 U EPO、100 U IL-3、14.3 mM/L 2-ME 3L，最后加入2.7%甲基纖維素0.3m L，混勻，重復(fù)3個皿，37℃，5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)10 ～14d，觀察CFU-E形成情況。

1.6.3 CFU-M ix培養(yǎng)

用甲基纖維素培養(yǎng)體系進行CFU-M ix培養(yǎng)。采用直徑為35mm塑料平皿，種入1m L培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基為IMDM，30%FBS、5000個細(xì)胞、10%0.1m L、10U EPO、PHA-LCM（植物凝集素-白細(xì)胞條件培養(yǎng)基）0.3m L、14.3 mM/L 2-ME 3L，最后加入2.7%甲基纖維素0.3m L，混勻，重復(fù)3個皿，37℃，5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)14～20d，觀察CFU-M ix形成情況。

1.6.4 統(tǒng)計學(xué)處理

等甲洛洛激動的心情漸漸平復(fù)，他又想起自己肩負(fù)的使命，既然小丁不是小偷，那小偷一定另有其人，可又是誰呢？他又開始從頭整理思緒：

集落數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±S）表示，若方差齊，采用 檢驗，若方差不齊，則采用 檢驗進行兩樣本間的比較。

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織AC133+細(xì)胞組分的百分率

胎盤組織AC133+細(xì)胞組分的百分率見表1。

2.2 胎盤AC133+HSPCS的血細(xì)胞系集落形成能力

2.2.1 CFU-GM形成能力

經(jīng)14d培養(yǎng)，胎盤AC133+細(xì)胞可見CFU-GM（見圖 1-A），其 CFU-GM 數(shù)為（37±3）/1×103。胎盤AC133-細(xì)胞組分無CFU-GM形成。

表1 胎盤單個細(xì)胞中AC133+細(xì)胞數(shù)量

2.2 CFU-M ix形成能力

經(jīng)14 d培養(yǎng)，胎盤AC133+細(xì)胞組分可見CFU-M ix形成（見圖1-B），其集落形成數(shù)是（34±5）/1×103。而胎盤AC133-細(xì)胞組分無CFU-M ix形成。

2.2.3 CFU-E形成能力

經(jīng)7d培養(yǎng)，胎盤AC133+細(xì)胞組分可形成CFUE，其集落數(shù)為（33±4）/1×103（見圖1-C）。胎盤AC133-細(xì)胞組分無CFU-E形成。

胎盤 AC133+細(xì)胞亞群 CFU-GM、CFU-M ix、CFU-E的形成能力無顯著差異（P>0.05）（見圖2）。

圖1 胎盤單個細(xì)胞CFU-GM、CFU-M ix F、CFU-GM集落形成圖

圖 2 PT-AC133+CFU-GM F、CFU-M ix、CFU-GM 集落形成數(shù)量比較

3 討論

長期以來，一直認(rèn)為CD34膜抗原是HSPC的特征性標(biāo)志，并用于造血干細(xì)胞的分選、擴增和重建造血等研究[11]。AC133是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的造血干細(xì)胞表面標(biāo)志，且越來越受到研究者重視[7，8]。M iraglia等的研究表明，AC133是一種5次跨膜糖蛋白，它不同于已知的4次和7次跨膜蛋白，是一種全新的跨膜蛋白，在早期造血調(diào)控中起重要作用[8]。最近由Yu等克隆并鑒定了一個新的AC133異構(gòu)體，命名為C133-2，并證明它是造血干細(xì)胞表達(dá)的表面特征性標(biāo)志[12]。AC133抗原主要表達(dá)于胎肝、骨髓和血液中CD34+造血干/祖細(xì)胞、所有非定向CD34+細(xì)胞及大多數(shù)定向于粒-單的CD34+細(xì)胞中[7]；AC133的表達(dá)在發(fā)育上早于CD34，并可替代CD34膜抗原標(biāo)記成為分選、擴增和移植造血干/祖細(xì)胞的標(biāo)志分子[13-15]。已有的研究涉及人骨髓、外周血、臍帶血AC133+細(xì)胞，目前，關(guān)于胎盤組織AC133+細(xì)胞生物學(xué)特性的報道還很不全面、系統(tǒng)。采用AC133膜抗原標(biāo)志來探索胎盤 AC133+細(xì)胞的造血干/祖細(xì)胞特性，可以補充該領(lǐng)域資料的欠缺。本實驗結(jié)果表明，胎盤組織含有豐富的AC133+造血干/祖細(xì)胞。

集落形成實驗是評價HSPC增殖分化能力的重要指標(biāo)。近年來有研究表明AC133+細(xì)胞形成CFUM ix和高增殖潛能集落形成細(xì)胞(HPP-CFC)的能力強于CD34+細(xì)胞，AC133+細(xì)胞具有更強的增殖潛能，可能比 CD34+細(xì)胞更為原始并包含更多的原始HSPC[16]。目前的研究表明，AC133+造血干細(xì)胞具有很強的多向分化能力和長期造血重建能力[17，18]。外周血 AC133+CD34+細(xì)胞亞群中長期培養(yǎng)起始細(xì)胞（LTC-IC）比AC133-CD34+部分高得多[19]。人臍帶血 AC133+細(xì)胞體外擴增中，AC 133+，AC133+CD34+，CD34+CD38-細(xì)胞的CFU-M ix和骨髓高增殖潛能集落形成細(xì)胞（HPP-CFC）的擴增倍數(shù)高于CD34+細(xì)胞，說明AC133是較CD34更為原始的造血干/祖細(xì)胞的表面標(biāo)志，AC133+細(xì)胞具有更強的擴增潛力[12]。本研究在采用MACS分選人胎盤AC133+、AC133-細(xì)胞組分的基礎(chǔ)上，分別對這兩個細(xì)胞組分進行了各系集落培養(yǎng)，結(jié)果顯示，胎盤AC133+細(xì)胞具有形成 CFU-GM、CFU-M ix、CFU-E的能力，AC133-細(xì)胞組分無此能力。這說明胎盤組織中的AC133+細(xì)胞組分具有HSPC特性，能夠多向增殖并分化為多種造血祖細(xì)胞，AC133膜抗原標(biāo)志可作為胎盤組織HSPC的分選標(biāo)志。集落形成實驗是評價造血干/祖細(xì)胞的客觀指標(biāo)之一，但因本實驗的樣本材料數(shù)量上不夠大，故尚需作進一步的研究。并且，在全面評價胎盤 AC133+細(xì)胞作為 HSPC的一種新的來源之前，還需對其體外擴增能力、黏附分子表達(dá)與歸巢能力、可塑性和造血重建能力等生物學(xué)特性進行研究。

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