龐莉 王晶 蔣延文
轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor betas,TGFβs)超家族分布于人體各個(gè)系統(tǒng),是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化成熟過程的極其重要的一類生長因子。它對于多種細(xì)胞功能都有調(diào)節(jié)作用,其調(diào)節(jié)功能涉及到胚胎發(fā)育、對疾病和傷害的反應(yīng)、成熟個(gè)體穩(wěn)態(tài)的保持等多個(gè)方面,細(xì)胞的遷移、生長、分化和細(xì)胞凋亡等一系列狀態(tài)[1]。TGFβs超家族的成員有抗苗勒氏管激素(anti-Muellerian hormone, AMH)、TGFβ、激活素、nodal、抑制素(Inhibins)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)等等40余種[2-3]。早期研究已經(jīng)顯示,Smad蛋白能夠被TGFβ誘導(dǎo)細(xì)胞膜受體直接激活,形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,進(jìn)一步控制轉(zhuǎn)錄核內(nèi)的靶基因轉(zhuǎn)錄(見圖1),細(xì)胞的多種分化成熟過程被調(diào)節(jié)。因此,它不但成為了TGFβ信號通路中的重要部分,同時(shí)共同調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,通過匯合其他信號通路。近年來發(fā)現(xiàn)其與多種疾病尤其是多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[2]。
1.1 組成和結(jié)構(gòu) 大約500個(gè)氨基酸組成Smad蛋白,包含球形結(jié)構(gòu)域兩個(gè),1個(gè)連接區(qū)。N-末端結(jié)構(gòu)域(又稱“mad-同源體1”,MH1)在所有R-Smad和Smad4中高度保守,而在Smad6和7中則例外。在不同的亞族中,C-末端(又稱為MH2結(jié)構(gòu)域)同MH1結(jié)構(gòu)域一樣高度保守[4],但連接區(qū)的變化較大。人類和小鼠基因組中各自編碼了8個(gè)Smad蛋白。Smad蛋白1、5和8屬于TGFβs家族中AMH和BMPs的通路受體底物[5],Smad2和Smad3是激活素、TGFβ、Nodal通路的受體底物。Smad4為所有R-Smad提供輔助。Smad6和Smad7能夠干擾和破壞Smad-受體或者Smad-Smad連接形成復(fù)合物,屬于抑制性Smad蛋白。Smad1、Smad2、Smad3、Smad5以及Smad8是受體調(diào)節(jié)Smad蛋白(receptor regulated Smads, RSmads),作為 TGFβs受體底物參與了哺乳動物信號傳導(dǎo)通路[6]。
圖1 TGFβs信號傳導(dǎo)通路
有研究通過X線分析了Smad蛋白MH1和MH2的空間結(jié)構(gòu),所有R-Smad和Smad4中都是借助一個(gè)高度保守-發(fā)夾結(jié)構(gòu)與MH1結(jié)構(gòu)域鏈接。而Smad2蛋白含量最多的剪接體中,一段外顯子3編碼的插入片段能夠阻止Smad蛋白與DNA結(jié)合。高度保守的Smad蛋白MH2結(jié)構(gòu)域參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中多種蛋白的相互作用。MH2結(jié)構(gòu)表面的親水區(qū)作用是控制核孔復(fù)合物(nuclear pore complex)、胞質(zhì)內(nèi)蛋白以及DNA結(jié)合輔助因子之間的相互作用。R-Smads C-末端含有保守的絲氨酸-X-絲氨酸模體,可以被磷酸化,鏈接受體和N末端形成了一個(gè)“口袋”狀結(jié)構(gòu)。橫跨連接區(qū)和MH2模體區(qū)的部分被認(rèn)為是Smad4蛋白激活區(qū)(Smad4 activation domain, SAD)能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活和抑制因子的相互作用[7-8]。
1.2 Smad錨蛋白 目前發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)Smad蛋白與受體相互作用的幾種錨蛋白中,作用最大的是Smad受體激活錨蛋白(smad anchor for receptor activation, SARA)[9],它在細(xì)胞膜及早期內(nèi)涵體膜上錨定Smad2/Smad3蛋白,以促進(jìn)與激活的TGF相結(jié)合[10]。同時(shí),還可通過特殊FYVE結(jié)構(gòu)域蛋白-Hgs,與SARA一起借助協(xié)同作用促使Smad蛋白磷酸化。雖然Smad1/Smad5/Smad8與BMPs通路有關(guān),但到目前為止仍然沒有證據(jù)顯示該通路上存在SARA樣因子,幫助激活的受體與RSmad蛋白相結(jié)合[9]。
2.1 Smad磷酸化受TGF受體激酶調(diào)控 TGF受體復(fù)合物活化后促進(jìn)Smad蛋白磷酸化是TGF信號傳導(dǎo)關(guān)鍵性的一步。TGF與TGFⅠ型(TR-Ⅰ)和Ⅱ型受體(TR-Ⅱ)成對結(jié)合,形成異源四聚體受體復(fù)合物,該復(fù)合物中TR-Ⅱ?qū)R-ⅠN末端的一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸富含區(qū)-GS區(qū)磷酸化。TR-Ⅱ在配體誘導(dǎo)的受體復(fù)合物中連接到TR-Ⅰ GS區(qū),催化蘇-蘇-絲-甘-絲-甘-絲氨酸中的蘇氨酸(或絲氨酸)殘基磷酸化[11])。磷酸化的GS區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)镾mad2/3結(jié)合區(qū)[12],再次促使Smad2/3磷酸化傳遞信號。一個(gè)包含R-Smad蛋白MH2 L3環(huán)結(jié)構(gòu)(L3loop)和Ⅰ型受體激酶結(jié)構(gòu)域中L45環(huán)結(jié)構(gòu)(L45loop)的特殊區(qū)域決定了R-Smad的底物特異性。L45loop決定磷酸化的GS區(qū)驅(qū)動受體特異性,調(diào)控與R-Smad相互作用。
位于R-Smad C末端的序列絲-纈-絲氨酸(在Smad2蛋白是絲-蛋-絲氨酸)發(fā)生受體調(diào)節(jié)的磷酸化反應(yīng),TGF-/Smad信號通路的標(biāo)志就是這種磷酸化的絲氨酸-X-磷酸化絲氨酸結(jié)構(gòu),該模體既可以出現(xiàn)在Ⅰ型受體磷酸化的R-Smad蛋白C末端,也可以出現(xiàn)在Ⅱ型受體磷酸化的Ⅰ型受體GS區(qū),此外,該模體還可以與C末端羧基配對形成雙磷酸-絲氨酸結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)可以同Smad4蛋白MH2區(qū)“口袋”結(jié)構(gòu)連接[13],構(gòu)成R-Smad-Smad4寡聚體進(jìn)入細(xì)胞核,達(dá)到調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄目的。
2.2 去磷酸化過程 刺激TGF/BMP 15~30 min后,Smad2/Smad3磷酸化水平達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(BMP通路中是Smad1/Smad5/Smad8)。當(dāng)濃度穩(wěn)定數(shù)小時(shí)后,細(xì)胞外TGF/BMP水平因受體失活或負(fù)反饋調(diào)節(jié)降低而逐漸導(dǎo)致Smad2/Smad3去磷酸化。Inman研究發(fā)現(xiàn),存在一種快速受體去磷酸化回到細(xì)胞膜過程,那么當(dāng)再次受到TGF/BMP等刺激時(shí),則再次磷酸化脫離細(xì)胞膜磷酸化Smad蛋白水平逐漸通過循環(huán)達(dá)到穩(wěn)定水平[14]。伴隨著R-Smad-Smad4復(fù)合物的解離回到胞,細(xì)胞核內(nèi)R-Smad蛋白去磷酸化。R-Smad蛋白調(diào)節(jié)同時(shí)包含,受體磷酸化-去磷酸化循環(huán)過程,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)磷酸化的受體與Smad4蛋白形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄,去磷酸化解離復(fù)合物,返回細(xì)胞質(zhì)。RSmad蛋白去磷酸化后與細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)的親和力降低,由細(xì)胞核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)遷移;與之相反,磷酸化后降低了與胞質(zhì)錨定點(diǎn)親和力的RSmad蛋白,解離后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),由此在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭往返[8]。確保了受體不斷被磷酸化激活。
2.3 Smad蛋白調(diào)節(jié) Smad蛋白活性受磷酸化C末端MH2結(jié)構(gòu)域和磷酸化連接區(qū)來實(shí)現(xiàn)。R-Smad蛋白連接區(qū)包含多個(gè)可以被多種激酶(如ERK MAP激酶)磷酸化的絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn),磷酸化后的R-Smad則對信號的反應(yīng)減低。R-Smad蛋白連接區(qū)的變異較大,使得上一級信號的選擇性調(diào)控成為了可能。Zavala-Gongora R等[15]的報(bào)道連接區(qū)可迅速將Smad蛋白和幾種不同的通路鏈接,但具體機(jī)制尚不十分清楚。
3.1 形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物 R-Smad蛋白被受體磷酸化后并與Smad4蛋白形成復(fù)合物成為許多靶基因調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素,Smad蛋白需要與DNA連接輔助因子結(jié)合獲得與DNA高度親和力,然后該復(fù)合物才可以通過MH1結(jié)構(gòu)域完成連接到DNA這一過程。
1998年,學(xué)者Zawel等[15]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),DNA上特殊的5’-GTCTAGAC-3’序列可以和Smad蛋白結(jié)合,進(jìn)一步研究中證實(shí)該序列為5’-GTCT-3’(或者是5’-AGAC-3’),簡稱SBE。許多Smad靶基因啟動子區(qū)帶有SBE,X線分析其空間結(jié)構(gòu)后,證實(shí)Smad蛋白通過發(fā)夾結(jié)構(gòu)與SBE結(jié)合。因?yàn)閱我坏腟BE不能提供足夠的親和力以促進(jìn)Smad蛋白結(jié)合,所以啟動因子區(qū)通常帶有多個(gè)SBE結(jié)構(gòu),可通過多個(gè)MH1與多個(gè)SBE結(jié)合以獲得足夠的DNA結(jié)合力[16]。所有的R-Smad蛋白和Smad4均可直接與DNA結(jié)合,同時(shí),MH1結(jié)構(gòu)域中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)Smad3蛋白與SBE的結(jié)合能力,發(fā)夾結(jié)構(gòu)插入DNA螺旋結(jié)構(gòu)大溝中,與SBE上的3個(gè)核苷酸通過氫鍵結(jié)合在一起[16]。和所有的R-Smad蛋白一樣,Smad4的-發(fā)夾結(jié)構(gòu)高度保守,這說明Smad蛋白與靶基因的結(jié)合不具有多樣性。在脊椎動物中,其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的附近含有Smad2蛋白3號外顯子編碼的插入片段,它可以阻止Smad蛋白與DNA的結(jié)合;反之,缺少插入片段的剪接體則可以與DNA結(jié)合。
R-Smad-Smad4寡聚體調(diào)節(jié)Smad蛋白復(fù)合物的活性,通過分析包含C末端絲氨酸殘基證實(shí),兩個(gè)磷酸化的R-Smad蛋白分子與一個(gè)Smad4蛋白分子形成異源三聚體構(gòu)成寡聚體[17],在X線分析復(fù)合物中磷酸化的MH2結(jié)構(gòu)域中獲得了相同的結(jié)論。在對體內(nèi)內(nèi)源性Smad轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的分析中發(fā)現(xiàn),復(fù)合物的組成表現(xiàn)的更為復(fù)雜,因受到與復(fù)合物中的其他因子和不同靶基因的影響,可形成異源二聚體和三聚體。
并不是所有TGF/BMP通路中靶基因都具有典型的SBE結(jié)構(gòu),一些靶基因只是在一定程度上可以通過類似序列與MH1結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。通過X線空間結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),在5’-GTCT-3’結(jié)構(gòu)中的第二位堿基T并不參與MH1結(jié)構(gòu)域結(jié)合,因此,其他堿基替代T[16]。在一些基因啟動子區(qū),Smad蛋白復(fù)合物識別GC富含區(qū),可以和啟動子區(qū)GCCGnCGC序列相結(jié)合。位于Smad6基因啟動子區(qū)的BMP反應(yīng)元件(BMP-responsive element, BRE)中存在4個(gè)GC富含模體,且互相重疊,因此可以和GCCGnCGC序列結(jié)合,但是,并非Smad1/Smad5/Smad8結(jié)合在GC富含模體上,而是Smad2/Smad3與SBE相結(jié)合,GC富含模體具有“Smad1結(jié)合元件”的功能。SBE和GC富含模體同時(shí)參加才能促使Smad1-Smad4復(fù)合物和Smad3-Smad4復(fù)合物連接在Id1基因啟動子區(qū)[18]。
3.2 Smad蛋白作用 結(jié)合于靶基因啟動子特定區(qū)域的Smad蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性是通過直接招募轉(zhuǎn)錄合作激活因子或抑制因子而得以實(shí)現(xiàn)的[19]。除此之外,還存在另外一些調(diào)節(jié)方式,如Smad蛋白與DNA結(jié)合因子合作調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)和Smad蛋白直接與激活因子或者抑制因子作用等等[20]。
轉(zhuǎn)錄激活能力需借助與異源Gal4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Gal4 DNA-binding domain, GBD)連接Smad1和Smad4蛋白MH2結(jié)構(gòu)域。融合有GBD的全長Smad1蛋白并不能激活轉(zhuǎn)錄,但是由于BMP信號通路激活后作用于內(nèi)源性Smad蛋白,其進(jìn)入細(xì)胞核與融合的Smad蛋白相作用,卻往往能夠產(chǎn)生對靶基因強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄活性[20]。
Smad蛋白可以通過廣泛地與輔助激活因子相互作用,將各種激活信號進(jìn)行整合。白細(xì)胞抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF)通過與BMP2協(xié)作誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化過程,刺激結(jié)合于它們信號通路下游P300不同部位的STAT3和Smad1,于整合信號后誘導(dǎo)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)基因啟動子激活來獲得實(shí)現(xiàn)[21]。
Smad蛋白并不僅僅具有轉(zhuǎn)錄激活作用,其在某種特定條件下還可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用,例如,Smad蛋白調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄抑制作用于TGF信號通路對c-Myc基因的調(diào)節(jié)過程中[22],這種抑制作用幾乎出現(xiàn)在所有的細(xì)胞類型中,其發(fā)生是通過E2F4或E2F5與DP1形成的異源二聚體與Smad3、Smad4組成的復(fù)合物,連接于c-Myc基因TIE上,從而實(shí)現(xiàn)抑制DNA的轉(zhuǎn)錄目的。
3.3 選擇靶基因 在與不同的DNA結(jié)合因子結(jié)合后,被激活的RSmad-Smad4復(fù)合物能夠高親和力和選擇性的連接到靶基因啟動子區(qū)。以下4種水平上DNA輔助因子可以調(diào)節(jié)Smad蛋白復(fù)合物結(jié)合的特異性:(1)轉(zhuǎn)錄作用特異性;(2)細(xì)胞類型特異性;(3)通路特異性;(4)靶基因特異性。
倘若靶基因啟動子區(qū)包含足夠的SBE,即使只存在Smad蛋白復(fù)合物靶基因也可能被激活,例如Smad7基因啟動子區(qū)中含有2個(gè)重復(fù)的SBE,TGF和BMP通路都可以直接激活該基因[19]。
3.4 轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)制性 早期研究發(fā)現(xiàn),Smad轉(zhuǎn)錄因子活性受到幾種機(jī)制限制,一種是下調(diào)轉(zhuǎn)錄機(jī)制,在TGF通路中的存在一種轉(zhuǎn)錄抑制因子——同源結(jié)構(gòu)域蛋白TGIF,它作為輔助抑制因子可以和Smad2蛋白相互作用,從而使其活性減低[15]。此外,其他一些調(diào)節(jié)蛋白與Smad蛋白本身,或者其輔助激活因子相互作用,能夠降低轉(zhuǎn)錄活性。
3.5 解除抑制和失活 Smad蛋白抑制轉(zhuǎn)錄可以通過抑制轉(zhuǎn)錄激活因子的活性來間接實(shí)現(xiàn)。Smad蛋白接受TGF信號后,一方面,Smad3蛋白和MyoD的基本螺旋-圈-螺旋(helixloop-helix, bHLH)結(jié)構(gòu)相結(jié)合,以防止形成MyoD-E12/47二聚體結(jié)合于靶基因E-盒反應(yīng)元件上,阻止肌源細(xì)胞分化;另一方面,通過移除某些靶基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄抑制因子,從而解除對靶基因的抑制作用。Marty T等[23]研究發(fā)現(xiàn),果蠅Dpp信號通路就是通過減低轉(zhuǎn)錄抑制因子Brinker對靶基因的抑制來完成對一些基因的調(diào)節(jié)的。
3.6 基因協(xié)同表達(dá) Baldessari 等[24]研究發(fā)現(xiàn),在同一組織中,一組基因的表達(dá)是協(xié)同完成的,尤其是容易出現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中,而基因協(xié)同表達(dá)在生物學(xué)上則具有更為重要的意義,有學(xué)者認(rèn)為,這些參與協(xié)同反應(yīng)的基因可能屬于同族基因,因此,能夠?qū)ο嗤蜃幼龀龇磻?yīng),但目前其具體機(jī)制尚不清楚。在果蠅研究中發(fā)現(xiàn),TGF家族信號通路中,轉(zhuǎn)錄復(fù)合物需要由輔助因子RSmad-Smad4共同構(gòu)成,一個(gè)BMP4信號協(xié)同組由Smad7、bambi和vent2三種基因共同構(gòu)成,并通過OAZ-Smad1-Smad4復(fù)合物和遠(yuǎn)處vent2基因啟動子區(qū)BRE相結(jié)合,共同實(shí)現(xiàn)對BMP4誘導(dǎo)調(diào)節(jié)過程[15]。
3.7 泛素化調(diào)節(jié)和乙?;饔?均典型的泛素化調(diào)節(jié)蛋白是Smad1和Smad2蛋白,受到TGF信號的積累刺激,磷酸化的Smad2與26S蛋白酶體中的磷酸酶迅速發(fā)生相互作用。除此之外,依賴泛素的蛋白酶體進(jìn)行緩慢地脫磷酸作用亦可發(fā)生。不同于Smad2蛋白,Smad1蛋白缺少BMP信號后磷酸化后,被依賴于泛素化E3連接酶Smurf破壞。另外一些Smurf家族成員成員具有相似的結(jié)構(gòu),可以作用于不同于其他信號傳導(dǎo)通路,如哺乳動物Smurf2調(diào)節(jié)Smad1、Smad2和Smad3,dSmurf調(diào)節(jié)果蠅胚胎發(fā)育。但是,即具備C末端HECT結(jié)構(gòu)域,并有一個(gè)N-C2磷脂蛋白和鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域是所有Smurf家族成員都存在共同點(diǎn)。Yang Q等[25]研究表明,Smad蛋白泛素化在一定條件下受到乙?;刂?,可通過相同賴氨酸殘基乙?;柚筍murf泛素化實(shí)現(xiàn),但該過程不會造成蛋白亞細(xì)胞分布的改變。
3.8 抑制性Smad蛋白 Smad6和Smad7為脊椎動物的抑制性Smad蛋白,相比與R-Smad或Smad4,二者的MH2結(jié)構(gòu)域缺少了C末端調(diào)節(jié)受體磷酸化位點(diǎn),Smad6主要抑制BMP通路,而Smad7則抑制TGF/激活素和BMP信號通路,過表達(dá)Smad6/Smad7均會對TGF和BMP通路起到抑制作用。
Smad6與Smad4競爭結(jié)合R-Smad1,可以通過形成Smad1-Smad6復(fù)合物抑制Smad1-Smad4活性復(fù)合物的形成。Smad6基因敲除的小鼠表現(xiàn)為BMP信號反應(yīng)增高,尤其是在心血管系統(tǒng)中,這是由于Smad4在這些組織中表達(dá)量較多所致的[26-27]。
Smad7能夠直接和R-Smad蛋白競爭,同時(shí)具有與TGF和BMP受體結(jié)合能力。在果蠅中研究中發(fā)現(xiàn),Smad7對TGF和BMP信號傳導(dǎo)進(jìn)行調(diào)節(jié)就是通過該種方式。Smad7除了具有競爭性抑制作用外,還能夠調(diào)節(jié)TGF和BMP通路中Smurf遍在蛋白連接酶體系對受體的遍在蛋白化作用。Smurf2連接到Smad7蛋白,是通過將Smurf-Smad7輸出到細(xì)胞質(zhì)中,降調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo),進(jìn)而調(diào)節(jié)Smad7的遍在蛋白化和降解Smad[26]。
3.9 信號整合的關(guān)鍵 TGF轉(zhuǎn)錄因子家族通過Smad信號通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、代謝遷移、定位以及凋亡等,它與其他信號通路正確整合調(diào)控,對于保證個(gè)體功能正常而言顯得尤為重要,Smad蛋白成為信號整合的關(guān)鍵。Smad蛋白家族提供了一個(gè)整合輸入信號平臺結(jié)構(gòu),它包含連接區(qū)、DNA結(jié)合輔助因子以及分子表面與這些因子所連接的部分,在這些結(jié)構(gòu)中,以疏水MH2結(jié)構(gòu)域中的走廊結(jié)構(gòu)為最重要的組成部分[28]。Smad蛋白可以通過上述3種元件與多種信號通路進(jìn)行連接,并將信號整合傳遞給細(xì)胞核內(nèi)靶基因,實(shí)現(xiàn)調(diào)控基因表達(dá)目的。
綜上所述,隨著不斷深入研究Smad蛋白家族發(fā)現(xiàn),三種不同類型的Smad蛋白之間存在相互協(xié)助作用,依賴Smad4和R-Smad組成活性復(fù)合物,借助一些輔助因子的幫助,進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)對靶基因表達(dá)予以調(diào)控。而抑制性Smad蛋白起到阻止活性復(fù)合物形成、確保Smad蛋白功能正常發(fā)揮的作用。Smad作為TGF-β通路的胞內(nèi)信號蛋白,受到多種信號通路的影響,Smad信號通路已成為TGF轉(zhuǎn)錄因子信號通路中重要的組成部分,既能夠廣泛調(diào)節(jié)多種基因表達(dá),也能夠在各個(gè)不同信號在胞內(nèi)整合中發(fā)揮作用,實(shí)現(xiàn)對于細(xì)胞核內(nèi)靶基因功能的共同調(diào)節(jié)。
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