姜智慧 陸曉媛 周健

姜黃素（Curcumin）是一種酚類化合物，提取自姜科姜黃屬植物姜黃（Curcumalonga）的根莖中，是中藥姜黃的主要成份。國(guó)內(nèi)外的科學(xué)研究表明，姜黃素具有具有抗炎、抗氧化、保肝、保護(hù)心臟、預(yù)防血栓和抗腫瘤的多種生物學(xué)效應(yīng)[1-4]。姜黃素可以調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)的細(xì)胞因子及通路達(dá)到抗腫瘤的作用，對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒作用[5]。但是有關(guān)姜黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞體外作用的相關(guān)機(jī)制仍有待研究。本文主要探討姜黃素對(duì)人類宮頸癌Hela細(xì)胞的相關(guān)作用，檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)情況，為姜黃素防治宮頸癌提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人宮頸癌Hela細(xì)胞株（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究中所惠贈(zèng)）。

1.2 主要試劑 姜黃素、二甲基亞砜（DMSO）、MTT購(gòu)自美國(guó)Singma公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖型購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RT-PCR 反應(yīng)試劑盒北京天根生化科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒（RTL-離心柱型）購(gòu)自上海銳捷生物工程有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；p53抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology公司;鼠抗β-actin抗體北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌Hela細(xì)胞株采用加入100 mg/L 鏈霉素和100 U/L 青霉素各1 ml的DMEM培養(yǎng)液，置于 37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至體積占細(xì)胞瓶體積比約 95%時(shí)，按1：2～3比例傳代。取細(xì)胞生長(zhǎng)良好，活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 姜黃素對(duì)Hela細(xì)胞增殖影響的檢測(cè) 用MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)Hela細(xì)胞增殖影響。用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將的Hela細(xì)胞配成 1×105/ml的懸液，在96孔板中加入 100μl細(xì)胞懸液，設(shè)5個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的姜黃素使其最終濃度為5、10、20、30、40、50μmol/L，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，分別培養(yǎng)12、24、48 h。培養(yǎng)結(jié)束后加入MTT（5 mg/L）20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出孔內(nèi)上清液100 μl，每空加入DMSO150 μl，震蕩使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定讀取Hela細(xì)胞的A490值，并按下述公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次以上。抑制率（%）=（1-給藥組 A490值/對(duì)照組A490值）×100%。

1.5 姜黃素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞細(xì)胞中p53基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響的檢測(cè) 用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中p53基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。收集姜黃素最終濃度為0、10、20、30、40 μmol/L的24 h Hela細(xì)胞為樣本。用離心柱法提取總的RNA，根據(jù)紫外分光光度計(jì)260nm處的吸光度值測(cè)定RNA的純度，并進(jìn)行RNA的定量配成相同濃度的RNA，取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成見(jiàn)表1。p53基因擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸1 min；循環(huán)36次；72℃再延伸10 min。β-actin 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；63℃退火30 s；72℃延伸1 min；循環(huán)36次；72℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)保存圖像，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次后，Quantity One 系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR 反應(yīng)的引物序列

1.6 姜黃素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞中p53蛋白含量表達(dá)的影響的檢測(cè) 姜黃素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞細(xì)胞中p53蛋白水平表達(dá)的影響的檢測(cè)用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平。收集姜黃素最終濃度為0、10、20、30、40 μmol/L的24 h三個(gè)時(shí)段Hela細(xì)胞為樣本。用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，蛋白提取試劑盒提取蛋BCA法進(jìn)行蛋白定量，將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度。取25 μl蛋白樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng) SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上， 常規(guī)步驟封閉、洗膜后加入1∶1 000 稀釋的兔抗人p53抗體；1∶1000 稀釋的鼠抗β-actin 抗體，4℃冰箱放置孵育過(guò)夜；TBST洗滌，加入1∶500 稀釋的HRP 標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠 IgG，室溫孵育2 h；ECL 底物化學(xué)發(fā)光顯色后曝光顯影，通過(guò) Bio-rad 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，各變量之間的關(guān)系采用直線相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 不同濃度姜黃素對(duì)人類宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制率

2.1 姜黃素對(duì)人類宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，于對(duì)照組相比，濃度為5 μmol/L的姜黃素對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯；濃度大于10 μmol/L時(shí)抑制作用明顯；當(dāng)濃度達(dá)到40 μmol/L時(shí)抑制作用最為顯著；但當(dāng)濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)抑制作用增加不明顯。試驗(yàn)表明經(jīng)不同濃度姜黃素處理不同時(shí)間后，Hela細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制，抑制率見(jiàn)表2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0. 05）。表明姜黃素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量-時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖1。

表2 姜黃素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制率（±s）

表2 姜黃素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制率（±s）

*與對(duì)照組相比， P<0.05

組別 12 h 24 h 48 h對(duì)照組 0.030±0.001 0.029±0.040 0.110 0.022* 0.129±0.010* 0.290 0.001* 0.254±0.029* 0.396?±0.149 5 μmol/L 0.093± ±0.010*10 μmol/L 0.125± ±0.144*20 μmol/L 0.230±0.002* 0.394±0.006* 0.416±0.008*30 μmol/L 0.442±0.021* 0.455±0.013* 0.481±0.007*40 μmol/L 0.559±0.016* 0.580±0.018* 0.647±0.007*50 μmol/L 0.573±0.004* 0.583±0.011* 0.681±0.027*

2.2 姜黃素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞細(xì)胞中p53基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響的檢測(cè) 取0、10、20、30、40 μmol/L姜黃素作用人宮頸癌Hela細(xì)胞24 h后，RT-PCR得到的p53 mRNA電泳條帶見(jiàn)圖2，條帶經(jīng)Quantity One 軟件后發(fā)現(xiàn)，姜黃素作用后的Hela細(xì)胞中p53基因mRNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，灰度值見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 不同濃度姜黃素作用24 h時(shí)p53 mRNA/β-actin相對(duì)灰度比值的情況（±s）

表3 不同濃度姜黃素作用24 h時(shí)p53 mRNA/β-actin相對(duì)灰度比值的情況（±s）

*與對(duì)照組相比， P<0.05

姜黃素濃度（μmol/L） p53mRNA/β-actin相對(duì)灰度比值0 0.427±0.005 10 0.479±0.004*20 0.537±0.007*30 0.605±0.006*40 0.655±0.007*

圖2 不同濃度姜黃素作用24 h后p53 mRNA的表達(dá)

2.3 姜黃素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞中p53蛋白含量表達(dá)的影響的檢測(cè) 取0、10、20、30、40 μmol/L姜黃素作用人宮頸癌Hela細(xì)胞作用24 h后，用Western blotting測(cè)得p53蛋白的表達(dá)隨著姜黃素濃度的增加而增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度姜黃素作用24 h后p53蛋白的表達(dá)情況

3 討論

姜黃是是天然存在的多酚類化合物，一種常用中藥，其主要成分姜黃素被用于食品行業(yè)作為食品添加劑，又因其為黃色的粉末，被染料業(yè)廣泛應(yīng)用。姜黃素曾經(jīng)被傳統(tǒng)的印度醫(yī)生用來(lái)治療厭食癥，鼻炎、咳嗽，鼻竇炎、肝損害[6-7]。近年來(lái)，姜黃素由于抗腫瘤的活性引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛的關(guān)注。單獨(dú)應(yīng)用姜黃素時(shí)發(fā)現(xiàn)，姜黃素有著抗腫瘤活性，同時(shí)具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的作用[8-9]。姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞均有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用[10]，對(duì)表皮生長(zhǎng)因子的促增殖作用有一定的拮抗效果[11]。還能抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中多種腫瘤的發(fā)生[12]，并且能縮腫瘤大小，顯著減少腫瘤數(shù)目，降低肺轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移。試驗(yàn)表明姜黃素能夠抑調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)病的相關(guān)基因，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的的3個(gè)階段即：?jiǎn)?dòng)期，加速期，對(duì)數(shù)期都有一定的抑制作用[13]。因此，姜黃素是目前化學(xué)預(yù)防和治療腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，有望成為一種具有廣泛應(yīng)用前景的抗癌新藥。

隨著化療藥物的使用，其毒副作用也不可忽視，如脫發(fā)、電解質(zhì)紊亂、口腔黏膜潰瘍和白細(xì)胞數(shù)降、惡心、腹瀉等。同時(shí)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性也逐漸加強(qiáng)，姜黃素是唯一未見(jiàn)任何毒副作用報(bào)道的抗腫瘤藥物。姜黃素可以減少化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的傷害，從而降低藥物的毒副作用，且有一定的化療增敏作用[14]。在聯(lián)合應(yīng)用姜黃素和奧沙利鉑的體外試驗(yàn)中時(shí)發(fā)現(xiàn)，姜黃素在明顯提高奧沙利鉑抗腫瘤作用的同時(shí)，還可以降低腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性[15]。在肝癌細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中，姜黃素分別于順鉑及阿霉素聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示姜黃素與順鉑聯(lián)合的效果較好，并且可以下調(diào)c-IAP、Bcl-xl、c-myc、NAIP 和 XIAP等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。姜黃素同時(shí)體內(nèi)外的宮頸癌細(xì)胞具有一定的抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用[17-18]。本文以人宮頸癌Hela細(xì)胞為標(biāo)本，加入不同濃度姜黃素后發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)Hela細(xì)胞有著一定的抑制作用，且呈時(shí)間-濃度依賴性，不同組別之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。加入姜黃素后的宮頸癌Hela細(xì)胞，從正常的長(zhǎng)梭狀，逐漸縮小、變成圓形，同時(shí)核固縮，核碎裂逐漸增多。

野生型p53基因（wtp53）是重要的抑癌基因之一，位于17號(hào)染色體短臂，編碼53kD核磷酸蛋白，p53蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控，阻止細(xì)胞從G期進(jìn)入S期擴(kuò)增，對(duì)細(xì)胞分裂及增殖起負(fù)調(diào)節(jié)作用。但是在體內(nèi)外致癌因素作用下，p53可發(fā)生突變，導(dǎo)致wtp53喪失功能成為變異性p53。突變的p53具有致癌的特性，它失去對(duì)細(xì)胞的抗凋亡能力，對(duì)細(xì)胞的過(guò)度增殖達(dá)不到阻滯作用，這就導(dǎo)致細(xì)胞在致癌因素的刺激誘導(dǎo)下可以無(wú)限制的增殖，發(fā)展成為腫瘤。對(duì)于p53的相關(guān)研究認(rèn)識(shí)后，學(xué)者們開(kāi)發(fā)研究出一中抗癌新藥：重組人p53腺病毒注射液。臨床研究表明，單獨(dú)或者聯(lián)合應(yīng)用重組人p53腺病毒對(duì)胃癌[19]、肝癌[70]、宮頸癌[21]、惡性腹水[22]等，有著較為明顯的治療效果。本論文主要研究不同濃度姜黃素作用下人宮頸癌Hela細(xì)胞中p53基因表達(dá)的情況的表達(dá)情況。取姜黃素濃度為0、10、20、30、40μmol/L作用24 h的Hela細(xì)胞為樣本，測(cè)樣本中p53mRNA的含量，結(jié)果可見(jiàn)隨著濃度的增加p53mRNA的含量逐漸增加；Western blotting結(jié)果顯示，隨著姜黃素濃度的增加p53蛋白含量明顯增加?？梢?jiàn)姜黃素可能通過(guò)誘導(dǎo)抑癌基因p53的表達(dá)，導(dǎo)致p53蛋白含量的增加，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的作用。

[1]Anand P， Sundaram C， Jhurani S， et al. Curcumin and cancer： An“old-age” disease with an “age-old” solution[J]. Cancer Lett， 2008，267（1）： 133-164.

[2]Anand P， Thomas SG， Kunnumakkara AB， et al. Biological activities of curcumin and its analogues （congeners） made by man and Mother Nature[J]. Biochem Pharmacol， 2008， 76（11）： 1590-1611.

[3]Aggarwal BB， Harikumar KB. Potential therapeutic effects of curcumin， the anti-inflammatory agent， against neurodegenerative，cardiovascular， pulmonary， metabolic， autoimmune and neoplastic diseases[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2009，41（1）：40-59.

[4]Srivastava RM， Singh S， Dubey SK， et al. Immunomodulatory and therapeutic activity of curcumin[J]. Int Immunopharmacol， 2011，11（3）：331-341.

[5]35. Notarbartolo M， Poma P， Perri D， et al. Antitumor effects of curcumin， alone or in combination with cisplatin or doxorubicin， on human hepatic cancer cells. Analysis of their possible relationship to changes in NF-kB activation levels and in IAP gene expression[J].Cancer Lett，2005， 224（1）： 53-65.

[6]Rahman I， Biswas SK， and Kirkham PA.Regulation of in?ammation and redox signaling by dietary polyphenols[J]. Biochem Pharmacol ，2006，72： 1439-1452.

[7]Tirkey N，Kaur G，Vij G，and Chopra K.Curcumin，a diferuloylmethane， attenuates cyclosporine-induced renal dysfunction and oxidative stress in rat kidneys [J].BMC Pharmacol ，2005， 15：20.

[8]Aggarwal BB， Kumar A. Bharti AC. Anticancer potential of cuecumin ：preclinical and clinical studies[J].Anticancer Res，2003，23（1A）：363-398.

[9]余俚瑤，張慶華.姜黃素抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的機(jī)制[J].腫瘤防治研究，2011，38（8）：899-902.

[10]曹澤毅.子宮頸癌治療的變遷和思考[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2005，14（1）：1-5.

[11]Reuter S，Eifes S，Dicato M，et a1.Modulation of anti-apoptotic and survival pathways by curcumm as a stramgy to induce apoptosis in cancel cells[J].Bioehem Pharmaeol，2008，76（11）：1340-1351.

[12]許剛，黃文姜.黃素防治腫瘤的機(jī)制研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)生理病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2003，23（2）：152-154.

[13]Singh S and Khar A. Biological effects of curcumin and its role in cancer chemoprevention and therapy[J]. Anticancer Agents Med Chem，2006，6： 259-270.

[14]Ajay Goel ，Bharat B， Aggarwa. Curcumin， the Golden Spice From Indian Saffron， Is a Chemosensitizer and Radiosensitizer for Tumors and Chemoprotector and Radioprotector for Normal Organs[J].Nutrition and Cancer， 2010，62（7）， 919-930.

[15]Howells LM， Mitra A， and Manson MM. Comparison of oxaliplatinand curcumin-mediated antiproliferative effects in colorectal cell lines[J].Cancer ，2007，10（2）：40.

[16]Notarbartolo M， Poma P， Perri D， et al. Antitumor effects of curcumin， alone or in combination with cisplatin or doxorubicin， on human hepatic cancer cells： analysis of their possible relationship to changes in NF-kB activation levels and in IAP gene expression[J].Cancer Lett ，2005，224：53-65.

[17]Zhao J， Zhao Y. Effects of curcumin on proliferation and apoptosis of human cervical carcinoma Hela cells invitro[J].Chinese Journal of Cancer Research，2004，16（3）：225-228.

[18]Zhao J ，Zhao Y， Zhang Y， et al. Anti-tumor effect of curcumin on human cervical carcinoma Hela cells in vitro and in vivo [J].Chinese Journal of CancerResearch，2007，19（1）：32-36.

[19]Xie YS， Zhang YH，Liu SP， et al.Synergistic gastric cancer inhibition by chemogenetherapy with recombinant humanadenovirus p53 and epirubicin： an in vitro and in vivo study[J]. Oncol Rep，2010，24（6）：1613-1620 .

[20]Guan YS，La Z ，Yang L ，et al.p53 gene in treatment of hepatic carcinoma： status quo[J].WorldJ Gastroenterol，2007，13（7）：985-992.

[21]王婷婷，韓春俠，鄭小莉. 重組人p53腺病毒注射液聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)的影響[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，32（2）：120-123.

[22]阮冬梅. 重組人p53腺病毒治療癌性惡性腹水的研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2011， 9（4）：32-33.