黃 俊，李家園，朱 祎，張清順，侯建軍*

（1. 污染物分析與資源化技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (湖北師范學(xué)院)，湖北 黃石 435002；2. 湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002 )

0 前言

六氯苯(HCB)是一類典型的持久性有機(jī)污染物(POPs)，能在環(huán)境中持久殘留，不易降解；能通過食物鏈的富集作用對生物造成嚴(yán)重影響；也能夠經(jīng)過長距離遷移到達(dá)遠(yuǎn)離污染源的地區(qū)，對接觸該物質(zhì)的生物造成損害[[1,2]。六氯苯在12種POPs中屬于較易揮發(fā)的農(nóng)藥，所以在合成和使用過程中，一定量的HCB能夠進(jìn)入環(huán)境并存留于水體、大氣、土壤和沉積物中[3,4]，對魚類和底棲生物產(chǎn)生較大威脅。目前，關(guān)于重金屬對水生生物生態(tài)毒理效應(yīng)的研究報道較多[5-7]，而關(guān)于有機(jī)物尤其是HCB對水生生物的影響研究相對較少。HCB毒性作用的主要靶器官是動物的肝臟[8]，鰓是直接暴露于水體的組織，其生理變化對HCB的脅迫較為靈敏[9]。HCB在體內(nèi)代謝時，可產(chǎn)生多種中間代謝產(chǎn)物，并伴隨產(chǎn)生大量的活性氧自由基(如O2-，·OH)[10]。人們在研究污染物的致毒機(jī)理中，發(fā)現(xiàn)污染物暴露過程中，機(jī)體在產(chǎn)生活性氧的同時，能誘導(dǎo)體內(nèi)相應(yīng)的抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)揮作用，而抗氧化防御系統(tǒng)的酶活性或含量也會隨著污染物的脅迫而發(fā)生相應(yīng)改變，如SOD，CAT，GST，GSH等均可被誘導(dǎo)，從而使機(jī)體免受氧化傷害[11]。因而，這些生物標(biāo)志物的活性變化能間接反映環(huán)境中氧化應(yīng)激的存在，可作為環(huán)境污染脅迫的指標(biāo)[12]。如 Peters等[13]據(jù)此認(rèn)定可以將抗氧化酶活性作為指示污染引起氧化脅迫的生物標(biāo)志物。

梨形環(huán)棱螺在我國分布廣泛，多生活在河流、池塘、湖泊等水體，是大型底棲生物的重要組成部分，在水生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用，它們很容易捕獲和在室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖，對污染物敏感性高[14]。本研究選用梨形環(huán)棱螺作為實(shí)驗(yàn)材料，通過暴露實(shí)驗(yàn)方法研究不同濃度 HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、GST、GSH)的變化情況，初步探討HCB對梨形環(huán)棱螺的的氧化脅迫及防御作用機(jī)理，為水環(huán)境POPs污染的早期診斷及生態(tài)風(fēng)險評價提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

梨形環(huán)棱螺(Bellamya purificata)采自于湖北省黃石市磁湖，質(zhì)量2±0.2g。實(shí)驗(yàn)前選擇健康的環(huán)棱螺放在水箱中適應(yīng)和馴養(yǎng)一個星期。馴養(yǎng)期間，實(shí)驗(yàn)用水為曝氣 3d 的自來水，每日換水一次，其它飼養(yǎng)環(huán)境條件是：pH 6.4，飼養(yǎng)溫度20~25 ℃；急性毒理實(shí)驗(yàn)前1天停止喂食，實(shí)驗(yàn)期間不喂食[15]。

1.2 儀器試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

相關(guān)儀器設(shè)備需要：紫外可見分光光度計(jì)（美國Thermo公司），高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf，5430R)，DIAX900微量勻漿機(jī)(德國Heidolph公司)等，HP300G-C型智能光照培養(yǎng)箱（瑞華儀器），雷磁PHS-25（上海精科）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

六氯苯(HCB)、NBT、EDTA 、L-Met 、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、NaOH固體、95%乙醇、85%磷酸、Brillisnt Blue G250、30%H2O2、DTNB、三氯乙酸（以上試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司），維生素C、硫代巴比妥鈉、二甲基亞砜(DMSO)（上述藥品均購自Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HCB在體毒物毒性暴露實(shí)驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)方法和在體毒性暴露試驗(yàn)采取我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立和使用的方法[15]。

1.3.2 酶樣的制備

酶樣制備方法和相關(guān)程序采用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立和優(yōu)化的方法[15]。

1.3.3 抗氧化酶活性的測定

SOD活性的測定采用NBT法[16]，酶活力單位定義為：每mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個活性單位(U)。CAT活性的測定采用紫外分光光度法[17]，酶活力單位定義為：每mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中每分鐘分解1μmol的H2O2的量為1個活性單位(U)。GST活性的測定采用CDNB法[18]，酶活力單位定義為：在25 ℃，pH 6.5，基質(zhì)CDNB與GSH終濃度均為1 mmol/L的條件下，1分鐘催化1 μmol/L CDNB與GSH結(jié)合的GST酶量為1U。

1.3.4 GSH的測定

GSH采用DTNB法測定[19]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means ±SD）表示，全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 16. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行對照組與各劑量組的兩兩比較，抗氧化指標(biāo)間的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，差異顯著用P<0.05表示，差異極顯著用P<0.01表示。繪圖軟件采用Orgin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓SOD活性的影響

由圖1A可知，各劑量組肝臟中SOD的活性在暴露的第1d 被誘導(dǎo)升高，8.0、16.0劑量組的酶升高了33%，2.0、4.0劑量組的酶活性升高了11%～16%（p<0.05）；隨后各劑量組SOD活性呈劑量依賴性回落，直至達(dá)到各自的最低值，此時，16.0與對照組相比下降了40%（p<0.01）；隨后除2.0劑量組保持緩慢上升趨勢直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束外，其余劑量組SOD活性均經(jīng)歷一個先上升后下降的過程；到第14天時，與對照組相比，2.0、4.0劑量組SOD活性約上升了5.6%（p>0.05），而16.0劑量組約下降了39%（p<0.01），已受到極顯著抑制，并且各劑量組的活性與其劑量呈負(fù)相關(guān)。

圖1B顯示，各劑量組鰓組織中SOD活性在暴露起始時均被顯著誘導(dǎo)升高，直至達(dá)到各自峰值，此時與對照組相比，2.0、8.0劑量組SOD活性上升了173%，4.0、16.0劑量組上升了100%左右（p<0.01）；隨后各劑量組SOD活性開始下降，其中2.0劑量組一直下降，至第7d時已降至對照組附近，并維持這一水平；16.0劑量組與對照組相比下降了32%后，處于抑制狀態(tài)，而8.0劑量組仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)。隨著暴露時間延長，各劑量組均呈現(xiàn)先上升后下降的波動變化；到第14d時，與對照組相比，16.0劑量組SOD下降了32%，處于顯著抑制狀態(tài)（p<0.05），4.0與8.0劑量組SOD活性雖分別上升了23.8%和43.5%，仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)。

圖1 HCB 對梨形環(huán)棱螺肝臟（A）和鰓（B）中SOD 活性的影響

2.2 不同濃度HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織CAT活性的影響

在圖2A中，肝臟各劑量組CAT在HCB暴露起始時，活性就被誘導(dǎo)升高，其中8.0劑量組升高率為45%（p<0.05），其他劑量組則上升了 15%左右； 除了 4.0劑量組的活性維持穩(wěn)定直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，而其他劑量組均下降到對照組附近，但仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)（p＞0.05）；從第2d開始，各劑量組CAT活性均被持續(xù)誘導(dǎo)升高，低劑量組（2.0mg/L）上升到了對照組的230%，其他則上升了67%（p<0.01）；之后，各劑量組CAT活性又急劇下降，到第14天時，2.0劑量組CAT活性為對照組的140%（p<0.01）；與對照組相比，8.0、16.0劑量組活性下降了11%，略低于對照組，最終表現(xiàn)出低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制的現(xiàn)象。

圖2B顯示，鰓組織CAT在HCB暴露后活性被誘導(dǎo)升高，其中2.0和4.0劑量組上升幅度較大，4.0劑量組的CAT活性上升到了對照組的300%（p<0.01）；然后活性開始下降，到第14天時，2.0劑量組的CAT活性為對照組的 125%（p<0.05），4.0劑量組為對照組的 167%（p<0.01）。8.0和16.0約上升了62%（p<0.05），之后又回落至對照組附近，但此時8.0劑量組酶活性略高于對照組，而16.0劑量組酶活性略低于對照組（p>0.05）。從第2d開始，這兩組酶的活性被持續(xù)誘導(dǎo)升高，達(dá)到峰值時，16.0劑量組CAT升高了80%，而8.0劑量組活性則上升到了對照組的260%（p<0.01）；之后其活性急劇下降，至第14d時，8.0劑量組與對照組活性相當(dāng)，而16.0劑量組與對照組相比，其活性下降了16%，已受到了輕微抑制（p>0.05）。

圖2 HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟（A）和鰓（B）中CAT 活性的影響

2.3 不同濃度HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織GST活性的影響

從圖3A可見，各劑量組肝臟中GST在暴露的第1d內(nèi)活性就被誘導(dǎo)上升，較對照組升高了15%～30%；之后各劑量組GST活性又回落到對照組附近（p＞0.05）；隨后GST活性又被持續(xù)誘導(dǎo)升高，直至達(dá)到各自的峰值，此時2.0劑量組GST活性升到了對照組的250%，4.0、16.0升到了對照組的200%，8.0升到了對照組的160%（p<0.01）。然后GST活性持續(xù)下降至第10天，在第10-14d其活性維持穩(wěn)定，其中2.0、4.0劑量組仍處于誘導(dǎo)狀態(tài)，而8.0和16.0劑量組則處于抑制狀態(tài)，其中4.0劑量組的GST活性較對照組上升了25%（p<0.05）。

在圖3B中，各劑量組鰓組織中的GST在暴露的第1d內(nèi)，其活性被誘導(dǎo)輕微上升（其中最高僅上升了2.5%），然后開始回落，第2d時，2.0和4.0劑量組略高于對照組，而8.0和16.0劑量組低于對照組（p>0.05）；隨后GST活性均被誘導(dǎo)上升到較高水平。此時，與對照組相比，2.0、4.0劑量組GST活性上升了175%左右，8.0、16.0劑量組上升了150%左右（p<0.01）；隨后GST活性急劇下降；到第14d時，中低劑量組的GST活性約為對照組的175%，仍處于顯著被誘導(dǎo)狀態(tài)（p<0.05），高劑量組（16.0 mg/L）與對照組相比約下降了15%，已受到輕微抑制。

圖3 HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟（A）和鰓（B）中GST 活性的影響

2.4 不同濃度HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓中GSH含量的影響

在圖4A中，在暴露的第1d內(nèi)，肝臟各劑量組的GSH均被誘導(dǎo)而緩慢上升，上升約25%后略有下降，至第2d時僅略高于對照組（p>0.05），然后GSH被顯著誘導(dǎo)升高，直至達(dá)到各自的峰值，并且其峰值與各自的劑量呈正相關(guān)。此時與對照組相比，高劑量組（16.0 mg/L）約上升了180%，低劑量組（2.0 mg/L）約上升了120%（p<0.01）。隨后各劑量組的GSH含量均持續(xù)下降，并且其下降的幅度同樣與各劑量呈正相關(guān)，低劑量組（2.0 mg/L）GSH含量僅僅有輕微回落，其他劑量組下降明顯；到第14d時，0.2劑量組僅下降了10%，含量仍極顯著高于對照組（p<0.01）；4.0劑量組約下降了58%，含量仍顯著高于對照組（p<0.05）；而8.0劑量組已下降至對照組附近，與對照組相比差異不顯著（p>0.05）；16.0劑量組的GSH含量已降至對照組以下，約下降了360%，其含量已被顯著抑制（p<0.05）。

圖4 HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟（A）和鰓中GSH（B）活性的影響

鰓組織GSH變化規(guī)律與肝臟相似（圖4B）。各劑量組鰓組織GSH在暴露的第1d內(nèi)均被誘導(dǎo)升高，含量均上升了200%-250%（p<0.01）；除2.0和8.0劑量組在第2d稍經(jīng)回落并再度持續(xù)上升外，其他各劑量組均保持上升趨勢，直至達(dá)到各自的峰值。其中，16.0劑量組最早達(dá)到峰值。此時，與對照組相比，高劑量組（16.0 mg/L）約上升了300%，中劑量組（4.0、8.0 mg/L）約上升了325%，低劑量組（2.0 mg/L）約上升了250%，其含量均極顯著高于對照組（p<0.01）。隨后，各劑量組GSH含量開始下降，并且其下降幅度與各劑量呈正相關(guān)，到第 14d時中低劑量組已下降至對照組的 175%－250%，但仍極顯著高于對照組（p<0.01）；16.0劑量組約下降了400%，并已降至對照組以下，其GSH含量已被抑制（p>0.05）。

3 討論及結(jié)論

3.1 HCB對梨形環(huán)棱螺SOD活性的影響

進(jìn)入生物體的 HCB能產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，而廣泛存在于螺組織細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)可將超氧陰離子自由基歧化成H2O2和O2·以保護(hù)細(xì)胞免受活性氧自由基的損傷[20,21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在較短的暴露時間內(nèi)（1d），梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織中的SOD活性能迅速升高，說明 HCB脅迫已產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起 ROS大量生成，從而誘發(fā)了 SOD活性增強(qiáng)，ROS被大量清除，因此又迅速降至對照水平或略低于對照組。隨著暴露時間的進(jìn)一步延續(xù)，自由基大量積累，過量積累的自由基則對抗氧化酶產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)作用，使 SOD活性代償性增強(qiáng)以平衡螺機(jī)體內(nèi)的氧化與抗氧化反應(yīng)[21,22]。當(dāng)HCB作用濃度過高，暴露時間過長, SOD的清除能力達(dá)到飽和時，活性氧大量積累，未被及時清除的自由基可對細(xì)胞產(chǎn)生毒性損傷，可導(dǎo)致 SOD活性受抑制[23]。所以在 HCB暴露后期，各劑量組 SOD酶活性急劇下降，并且高劑量組 SOD活性已處于抑制狀態(tài)。蔣舜堯等[24]在研究HCB對鯽魚肝臟線粒體保護(hù)酶 SOD、CAT活性的影響時，也有相似的現(xiàn)象出現(xiàn)，酶活性在低濃度受誘導(dǎo)，而高濃度下則受抑制。

3. 2 HCB對梨形環(huán)棱螺CAT活性的影響

過氧化氫酶(CAT)作為 H2O2濃度的調(diào)節(jié)器，可進(jìn)一步將 H2O2轉(zhuǎn)化成H2O，從而使機(jī)體免受活性氧的損傷[25]。HCB暴露起始時，由于 ROS產(chǎn)生及 SOD對活性氧的歧化作用，導(dǎo)致 H2O2升高，刺激體內(nèi) CAT表達(dá)釋放和活力增強(qiáng)；當(dāng) H2O2被分解后，CAT活性同樣降至對照組附近，即表現(xiàn)出短期激活然后下降的的變化規(guī)律，這與李康等[26]對鯽魚的報道頗為相似。隨著暴露時間延長，一方面由于螺體內(nèi)積累的 HCB激發(fā)了H2O2大量生成，另一方面因 ROS大量生成，導(dǎo)致 SOD應(yīng)激產(chǎn)生歧化反應(yīng)，也產(chǎn)生大量 H2O2，使CAT活性被誘導(dǎo)而增強(qiáng)。但隨后CAT活性顯著下降，這說明 CAT等作為活性氧清除劑，只能在一定程度上清除體內(nèi)過量活性氧，來維持體內(nèi)活性氧代謝平衡，降低脂質(zhì)過氧化作用。一旦 HCB在機(jī)體內(nèi)蓄積引起濃度升高，將導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基不能及時被清除，進(jìn)一步對包括抗氧化酶在內(nèi)的細(xì)胞胞內(nèi)酶形成抑制，因此其清除活性氧的功能也隨之下降[27]。

3.3 HCB對梨形環(huán)棱螺GST活性的影響

GST是細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)Ⅱ階段中具有解毒作用的重要酶蛋白[28]，具有消除體內(nèi)自由基和解毒的雙重功能，它可以催化GSH與許多次級底物結(jié)合，包括脂質(zhì)過氧化的次級產(chǎn)物，從而解除內(nèi)源性或外源性毒物的毒性作用[29]，所以在保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化損傷中意義重大。本實(shí)驗(yàn)剛開始時，因自由基的生成引發(fā) GST同樣表現(xiàn)出一種應(yīng)激反應(yīng)，酶活性被誘導(dǎo)增強(qiáng)；當(dāng)活性氧被清除，GST活性降至對照組附近。隨著暴露時間進(jìn)一步延長，活性氧大量產(chǎn)生，GST與其他抗氧化酶如 SOD、GPx 等在組織中協(xié)同表達(dá)而使其活性顯著升高[30]；當(dāng) GST達(dá)到峰值后，可能由于機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)其他成分如 SOD、CAT等的介入，體內(nèi)活性氧被清除，此時 GST濃度急劇下降，其原因可能是由于螺體內(nèi) GST代謝 HCB的能力被飽和，使螺出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，進(jìn)而使 GST活性受到抑制[31]。GST在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，也同樣表現(xiàn)出低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制的現(xiàn)象。

3.4 HCB對梨形環(huán)棱螺抗氧化指標(biāo)GSH的誘導(dǎo)和抑制

GSH是動物體內(nèi)重要的水溶性抗氧化劑，是 GST和 GPx的輔助因子，兩酶均能催化其與污染代謝物和H2O2結(jié)合而達(dá)到解毒目的，同時它還能夠清除氧自由基、阻止脂質(zhì)過氧化以保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[32]，或通過消除有害的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物如MDA，來阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[33]。此過程中 GSH的含量會因污染脅迫而發(fā)生改變。本試驗(yàn)中，在 HCB暴露的1d內(nèi)，GSH含量就被誘導(dǎo)升高，可能是 GSH因HCB的暴露而產(chǎn)生了適應(yīng)性的誘導(dǎo)反應(yīng)；同時，GSH與 HCB結(jié)合而產(chǎn)生的解毒效應(yīng)又導(dǎo)致GSH消耗。短時間內(nèi)當(dāng)這兩個過程達(dá)到動態(tài)平衡時，GSH含量下降到正常值附近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨暴露時間延長GSH含量表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制，這是因?yàn)殡S著HCB暴露時間進(jìn)一步延長，自由基大量生成，為調(diào)節(jié)生物體內(nèi)自由基濃度平衡，GSH含量被誘導(dǎo)顯著升高。在一定暴露濃度范圍內(nèi)，GSH 對HCB的適應(yīng)性能力隨著污染程度的增加而降低，HCB對GSH 的抑制效應(yīng)隨著污染程度的增加而加大，GSH因中毒過深而導(dǎo)致其含量降低。GSH達(dá)到峰值后，其含量急劇下降，一方面，GSH可直接通過供H+，拮抗氧自由基毒性，本身被氧化而使其含量降低；另一方面，GSH與作為底物的HCB及其代謝物發(fā)生共軛作用也會導(dǎo)致其含量下降[34]。至14d時，中低劑量組的GSH仍顯著高于對照組，而高劑量組已被抑制，表明低濃度HCB可對GSH的含量產(chǎn)生顯著誘導(dǎo)效應(yīng)，而高濃度產(chǎn)生抑制效應(yīng)。張景飛等[12]對鯽魚進(jìn)行原油暴露實(shí)驗(yàn)時也發(fā)現(xiàn)，低濃度毒物暴露時，GSH被誘導(dǎo)，而高濃度暴露時GSH則被抑制。試驗(yàn)結(jié)果顯示，HCB的短期暴露就會造成 GSH含量上升，GSH含量顯著降低則暗示著污染的加劇。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

HCB對梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓中SOD、CAT、GST活性和GSH含量均有明顯影響。各抗氧化指標(biāo)在HCB暴露后均受到誘導(dǎo)而升高，隨后又回落。隨著暴露時間的延長，各抗氧化指標(biāo)又呈現(xiàn)出顯著的先上升后下降趨勢，最終表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制。

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