姜 紅 李蘭芳 解麗君 李國(guó)風(fēng) 郝 娜 李立萍 張勤增

(河北省疾病預(yù)防控制中心藥物研究所，河北 石家莊 050021)

連翹(fructus forsythiae) 始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl 的干燥果實(shí)，產(chǎn)于我國(guó)東北、華北、長(zhǎng)江流域至云南，傳統(tǒng)醫(yī)藥多用于治療呼吸道感染、急性腎炎、肝炎及腦膜炎等疾病，重用連翹還可用于治療變應(yīng)性紫癜、糖尿病，有抗流感病毒的作用[1-2]。河北太行山區(qū)野生連翹資源豐富，民間常用連翹葉制成保健茶飲用，發(fā)現(xiàn)有消炎、通便等良好的保健作用。我們對(duì)河北省石家莊市井陘縣洞陽(yáng)坡5、8、10月份采收連翹葉所含總黃酮及蘆丁進(jìn)行測(cè)定，觀察連翹最佳采摘時(shí)期。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及試劑 連翹葉5、8、10月采自河北省石家莊市井陘縣洞陽(yáng)坡，連翹葉曬干、搓碎裝入瓶中，標(biāo)記采摘時(shí)間備用。不同濃度乙醇：45%、55%、65%、75%、85%、90%乙醇(用95%的乙醇與適量蒸餾水混勻配成，用酒精計(jì)測(cè)定)，95%乙醇。蘆丁對(duì)照品：購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)10080-200306。實(shí)驗(yàn)用甲醇為色譜純。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為化學(xué)純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 加樣器(eppendorf)，電子天平[PL203，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，電子分析天平[AE240，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，722分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)，Agilent-1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。

1.2 方法

1.2.1 分光光度法總黃酮(蘆丁)測(cè)定

1.2.1.1 對(duì)照品溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取在120 ℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品28 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液(每mL中含無(wú)水蘆丁0.112 mg)。

精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL容量瓶中，用亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c比色法，參照文獻(xiàn)[3]選擇波長(zhǎng)為500 nm。測(cè)定其吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.045 65X-0.0057，R=0.999 9。

1.2.1.2 不同乙醇濃度及提取時(shí)間連翹葉提取的篩選 精密稱取1 g連翹葉7份，用濾紙包好置索氏提取器中，分別用45%、55%、65%、75%、85%、90%、95%的乙醇90 mL提取2 h，放冷，倒入100 mL容量瓶中，洗滌圓底燒瓶?jī)杀榈谷肴萘科恐校ㄈ葜量潭?，搖勻。

分別精密量取不同濃度乙醇提取物10 mL于100 mL容量瓶中，用亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c比色法，選擇波長(zhǎng)為500 nm。測(cè)得總黃酮含量分別為44.49、45.40、46.68、46.68、47.77、49.05、47.41 mg/g。85%～95%乙醇連翹葉提取物中總黃酮含量較高。

精密稱取1 g連翹葉9份，選85%、90%、95%的乙醇分別提取1、1.5、2 h測(cè)定吸光度，計(jì)算連翹葉中總黃酮含量。

1.2.1.3 樣品測(cè)定 精密稱取不同采收時(shí)期連翹葉粗粉1.000 g，濾紙包好置索氏提取器中，用85%乙醇提取1.5 h，放涼，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容至刻度。精密量取10 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取稀釋液3 mL，置25 mL容量瓶中，依次測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量(以無(wú)水蘆丁計(jì))。

1.2.2 高效液相法蘆丁測(cè)定

1.2.2.1 蘆丁的色譜條件 色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇：雙蒸水=49∶51，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品7.21 mg溶于少量甲醇中，移至25 mL容量瓶中，超聲振蕩溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻。精密量取5 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配成0.058 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μL，以對(duì)照品進(jìn)樣量對(duì)峰面積做圖，計(jì)算回歸方程，Y=1.069 8×103X+6.162 0×102，R=0.998 6，線形范圍為0.288 4～2.880 μg。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取不同采收時(shí)間的連翹葉粗粉1.000 g，均平行稱取3份，用濾紙包好，裝入索氏提取器中，用85%乙醇提取1.5 h，放涼，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，吸取該溶液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。

1.2.2.4 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取制備好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液10.0 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得其峰面積，經(jīng)計(jì)算蘆丁RSD=1.32%(n=5)，說(shuō)明方法精密度良好。

1.2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10.0 μL，在0、4、8、12、16、20、24 h分別進(jìn)樣，記錄相應(yīng)保留時(shí)間的峰面積，蘆丁的RSD=1.64%(n=7)，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10.0 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄相應(yīng)保留時(shí)間的峰面積，蘆丁的RSD=2.45%(n=5)，該方法重復(fù)性好。

1.2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份連翹葉粗粉0.500 g，加入適量的蘆丁對(duì)照品，6份樣品均按照供試品溶液的制備方法處理后，精密吸取10.0 μL進(jìn)樣，記錄蘆丁相對(duì)應(yīng)的峰面積，計(jì)算含量和回收率，蘆丁回收率為98.3%，RSD=1.2%(n=6)，說(shuō)明該方法有較好的準(zhǔn)確度。

1.2.2.8 樣品中蘆丁含量測(cè)定 用制備好樣品溶液，按照蘆丁的色譜條件測(cè)定樣品中蘆丁含量。

2 結(jié) 果

2.1 不同乙醇濃度、時(shí)間連翹葉提取物總黃酮含量比較 見(jiàn)表1。

表1 不同乙醇濃度、時(shí)間連翹葉提取物總黃酮含量比較

由表1可見(jiàn)，85%乙醇提取1.5 h所得連翹葉提取物總黃酮含量較高為49.96 mg/g，選擇該條件作為連翹葉的提取條件。

2.2 不同采收時(shí)期連翹葉提取物總黃酮含量比較 見(jiàn)表2。

表2 不同采收時(shí)期連翹葉提取物總黃酮含量比較

由表2可見(jiàn)，分光光度法測(cè)定5、8、10月的連翹葉提取物中總黃酮的含量分別為4.230%、 6.785%、4.266%。

2.3 不同采收時(shí)期連翹葉中蘆丁的含量比較 見(jiàn)表3。

表3 不同采收時(shí)期連翹葉中蘆丁的含量比較

由表3可見(jiàn)，高效液相色譜法測(cè)得5、8、10月連翹葉提取物的蘆丁含量分別為2.030%、2.372%、1.867%。

3 討 論

以總黃酮為指標(biāo)成分，連翹葉的最佳提取條件為：使用濃度為85%的乙醇回流提取1.5 h。8月份采集的連翹葉總黃酮和蘆丁的含量最高，建議8月份采集。

黃酮類物質(zhì)是自然界中存在的酚類物質(zhì)，亦稱維生素 P，常與維生素 C伴存，是自然界藥用植物中的主要活性成分之一，有較強(qiáng)的抗氧化作用。有實(shí)驗(yàn)表明，連翹葉提取物具有顯著的抗氧化[4-5]、抗衰老和降血脂作用[6]，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)其具有抗艾滋病病毒的作用[7]。

而蘆丁是其中一個(gè)典型代表，具有抗氧化、降低毛細(xì)血管脆性和通透性等多種活性，有報(bào)道蘆丁對(duì)大鼠應(yīng)激性胃黏膜損傷具有預(yù)防性保護(hù)作用[8]，黃酮類化合物及蘆丁具有廣泛的利用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)表明8月份連翹葉中總黃酮含量6.785%。有報(bào)道連翹葉能通過(guò)清除活性氧自由基及提高抗氧化酶活力，具有一定的抗氧化及抗衰老藥用價(jià)值[9]。其作用是黃酮的功效，還是多種物質(zhì)的協(xié)同作用，值得進(jìn)一步研究。

連翹果實(shí)是我國(guó)傳統(tǒng)上最為常用的清熱解毒藥之一。有研究表明，連翹屬植物葉子和果實(shí)的成分有較好的一致性，而且葉子的有效成分如木脂素、咖啡酰糖苷等的含量較果實(shí)中高[7]。連翹葉資源的開(kāi)發(fā)有較好的前景，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同采摘期、不同提取條件，所得黃酮含量不同，對(duì)指導(dǎo)當(dāng)?shù)剡B翹葉種植、采摘、加工有一定指導(dǎo)作用，同時(shí)對(duì)連翹葉能否與果實(shí)一樣作為藥用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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