徐小惠，段莉麗，崔建升

(1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050018)

葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象是由Kautsky在1931年首先用肉眼發(fā)現(xiàn)[1]，之后逐步發(fā)展形成葉綠素?zé)晒饫碚?。葉綠素分子吸收光后會(huì)由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，會(huì)通過(guò)進(jìn)行光合作用、發(fā)出熒光和以熱的形式耗散而釋放能量，三者具有互補(bǔ)關(guān)系。對(duì)于色素分子來(lái)講，熒光發(fā)生在ns級(jí)，而光化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在ps級(jí)，一般光能主要是用于光化學(xué)消耗的，所以可以通過(guò)熒光的變化探測(cè)光合機(jī)構(gòu)的變化和光合作用受環(huán)境等的影響[2-3]。

LU等在2000年利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)研究了汞對(duì)藍(lán)藻的急性毒性作用，發(fā)現(xiàn)隨Hg2+濃度的升高，鈍頂螺旋藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)逐漸下降[4]。EULLAFFROY等在2003年利用LS50B-PerkinElmer熒光儀研究幾種除草劑對(duì)斜生柵藻的毒性作用，研究結(jié)果表明，斜生柵藻在684 nm和735 nm處的葉綠素?zé)晒獗嚷?F684/F735)可作為檢測(cè)水中抑制光合作用的除草劑毒性的指標(biāo)，隨著除草劑濃度的增大，F(xiàn)684/F735也不斷增大，且呈正相關(guān)關(guān)系[5]。王麗等在2008年利用雙通道脈沖振幅調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)量三角褐指藻的熒光強(qiáng)度，對(duì)莠去津進(jìn)行檢測(cè)，熒光強(qiáng)度隨莠去津濃度的增大而增大，其檢出限為0.5 μg/L[6]。田程在2010年利用葉綠素在線分析儀測(cè)量斜生柵藻熒光強(qiáng)度，以HgCl2為參比毒物，初步建立毒性評(píng)價(jià)等級(jí)[7]。葉綠素?zé)晒夥椒z測(cè)方便，且靈敏快速，得到了廣泛的應(yīng)用。

藻類是水體的初級(jí)生產(chǎn)者，最先受到水環(huán)境中污染物的毒害作用[3，8-9]，且藻類熒光對(duì)污染物毒性作用敏感，故藻類熒光常被用來(lái)研究污染物對(duì)微藻的影響。汞能抑制藻類光合作用，影響其葉綠素合成；還可影響藻類的生長(zhǎng)，損傷細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增大[10]。銅綠微囊藻屬藍(lán)藻，在水環(huán)境中很常見，且會(huì)在溫暖的季節(jié)大量生長(zhǎng)形成水華，其主導(dǎo)光合色素為葉綠素a和藻藍(lán)蛋白，對(duì)應(yīng)的熒光激發(fā)波長(zhǎng)為435 nm和610 nm[11]，其熒光信號(hào)對(duì)重金屬等污染物敏感。本文以銅綠微囊藻為材料，研究不同質(zhì)量濃度的Hg2+在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒獾挠绊?，探索銅綠微囊藻對(duì)Hg2+的響應(yīng)特性，豐富葉綠素?zé)晒夥ǖ睦碚摵蛻?yīng)用。

1 材料與方法

1.1 生物材料

實(shí)驗(yàn)所用銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)藻種購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。

使用BG-11培養(yǎng)基，于無(wú)菌條件下將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。銅綠微囊藻的培養(yǎng)條件是：光照度為2 000～2 500 lux，溫度為(25±1)℃，濕度為75% RH，光暗周期為12 h∶12 h，靜置培養(yǎng)。每日搖瓶2～3次，每次隨機(jī)調(diào)換錐形瓶的位置，以免引起光照不均。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出銅綠微囊藻在680 nm處[12]的光密度(DD)小于0.600時(shí)，其藻液濃度與葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)前對(duì)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻藻液進(jìn)行稀釋, 使之在680 nm處的OD值為0.400。

1.2 儀器與試劑

RGX-250型人工氣候箱(天津市泰斯特儀器有限公司提供)、722型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司提供)、日立F-7000熒光光譜儀(天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司提供)。F-7000熒光光譜儀工作參數(shù)：狹縫為5 nm，掃描速度為2 400 nm/min，激發(fā)波長(zhǎng)為400～500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為600～700 nm，步長(zhǎng)為5 nm，電壓為700 V，1 cm的標(biāo)準(zhǔn)四通石英比色皿。

HgCl2，由姜堰市環(huán)球試劑廠提供。實(shí)驗(yàn)設(shè)定HgCl2的質(zhì)量濃度分別為0.000 5，0.001，0.010，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500 mg/L。

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

使用F-7000熒光光譜儀進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。先對(duì)銅綠微囊藻進(jìn)行三維掃描，初步確定銅綠微囊藻的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)[13]，然后進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，比較激發(fā)與發(fā)射光譜圖，確定銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒獾淖罴鸭ぐl(fā)波長(zhǎng)(Ex)與發(fā)射波長(zhǎng)(Em)，然后在該Ex/Em波長(zhǎng)下測(cè)定加入HgCl2標(biāo)準(zhǔn)液前后銅綠微囊藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠微囊藻特征參數(shù)的確定

葉綠素a的激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)為435 nm/684 nm，而不同介質(zhì)中的葉綠素a具有不同的熒光光譜[14]，故不同種類的藻的葉綠素最佳激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)不同。F-7000熒光光譜儀對(duì)銅綠微囊藻在激發(fā)波長(zhǎng)為435 nm處進(jìn)行熒光光譜掃描，獲得銅綠微囊藻熒光光譜圖(見圖1)。由圖1可知，銅綠微囊藻在680 nm處有一峰，對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度最大；在660 nm前有一個(gè)相對(duì)平緩的峰，對(duì)應(yīng)的是銅綠微囊藻的藻藍(lán)蛋白。最終確定銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒獾淖罴鸭ぐl(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)為435 nm/680 nm。

2.2 銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈱?duì)Hg2+毒性作用的響應(yīng)時(shí)間的確定

圖1 銅綠微囊藻在激發(fā)波長(zhǎng)為435 nm處的熒光光譜Fig.1 Chlorophyll fluorescence emission spectra of Microcystis aeruginosa at 435 nm excitation

為了提高水質(zhì)檢測(cè)效率，縮短檢測(cè)時(shí)間，建立一種快速簡(jiǎn)便的水質(zhì)檢測(cè)方法，即需要在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)信號(hào)對(duì)毒物毒性有響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)采用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)，在銅綠微囊藻藻液中加入1 mL的HgCl2溶液，檢測(cè)熒光信號(hào)對(duì)Hg2+的毒性的響應(yīng)作用，發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨時(shí)間變化增大，熒光信號(hào)有明顯響應(yīng)。據(jù)報(bào)道，溫度對(duì)藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)與生長(zhǎng)有影響[15]，可能也會(huì)對(duì)葉綠素?zé)晒忭憫?yīng)Hg2+的毒性時(shí)間有影響。用不同溫度處理藻液，觀測(cè)溫度對(duì)響應(yīng)時(shí)間的影響，以獲取最佳反應(yīng)溫度，縮短響應(yīng)時(shí)間。

圖2 不同溫度處理銅綠微囊藻響應(yīng)HgCl2生物毒性的影響Fig.2 Temporal evolution of chlorophyll fluorescence intensity in temperature-exposed Microcystis aeruginosa

圖3 不同初始藻液濃度對(duì)銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒忭憫?yīng)Hg2+毒性作用的響應(yīng)時(shí)間的影響Fig.3 Temporal evolution of chlorophyll fluorescence intensity in Microcystis aeruginosa with different initial concentration

圖2表明，溫度分別為20，23，25，27，30 ℃時(shí)，加入HgCl2標(biāo)準(zhǔn)液的銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)基本一致，均逐漸增強(qiáng)。在0～10 min內(nèi)葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度緩慢增大，在10～20 min內(nèi)熒光強(qiáng)度急劇增大，銅綠微囊藻與Hg2+充分反應(yīng)，且銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度在20 min時(shí)達(dá)到最大，20 min后熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。故20～30 ℃范圍內(nèi)的溫度均可作為實(shí)驗(yàn)溫度。從圖2中還可以看出隨溫度的增加，葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度有一定降低。這與報(bào)道中的結(jié)論一致，所有的熒光都不同程度的受溫度影響, 溫度與熒光成反比[16]。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)使用培養(yǎng)時(shí)間不同但均處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的藻液(即未經(jīng)稀釋的初始藻液濃度不同)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得的響應(yīng)時(shí)間不同。用滅菌的蒸餾水將不同濃度銅綠微囊藻均稀釋至OD值為0.400進(jìn)行響應(yīng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻OD值在0.885～1.804范圍內(nèi)，初始藻液濃度越大，響應(yīng)時(shí)間越短，銅綠微囊藻的葉綠素?zé)晒鈱?duì)Hg2+毒性作用響應(yīng)越快。

圖3可以看出，銅綠微囊藻OD值為1.804時(shí)，加入HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液后，0～25 min熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增加，25～35 min熒光強(qiáng)度有下降趨勢(shì)，在25 min處熒光強(qiáng)度最大。藻液OD值為1.453時(shí)，10 min 以后葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度急劇增大，20 min后熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。而藻液OD值為0.885時(shí)，熒光強(qiáng)度一直隨時(shí)間增大，在35 min時(shí)還未達(dá)到穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)選用初始藻液濃度OD大于1.400的銅綠微囊藻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同濃度Hg2+對(duì)銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

一定濃度的Hg2+對(duì)銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒饩哂忻黠@的影響。取銅綠微囊藻與HgCl2標(biāo)準(zhǔn)液在50 mL錐形瓶中按體積1∶100比例混合反應(yīng)，25 min后測(cè)定葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化。每一濃度設(shè)置3個(gè)平行樣，設(shè)置一組空白樣(加入100 μL滅菌的蒸餾水)。

結(jié)果表明(見圖4)，較低質(zhì)量濃度Hg2+(0.000 5 mg/L)處理的銅綠微囊藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度較對(duì)照組熒光強(qiáng)度有所減小，相對(duì)熒光強(qiáng)度為負(fù)值。0.001～0.400 mg/L Hg2+處理過(guò)的銅綠微囊藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度有所增加，其相對(duì)熒光強(qiáng)度隨Hg2+質(zhì)量濃度的增大而增大，且在該Hg2+質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，銅綠微囊藻的相對(duì)熒光強(qiáng)度與Hg2+質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，回歸方程為y=23.699x-0.249，r=0.983 3。而Hg2+質(zhì)量濃度為0.500 mg/L時(shí)，葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度增大，但相對(duì)熒光強(qiáng)度較0.400 mg/L Hg2+處理組的相對(duì)熒光強(qiáng)度低很多，與0.300 mg/L Hg2+處理組的相對(duì)熒光強(qiáng)度相當(dāng)，且鏡檢發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞較正常藻細(xì)胞體積增大。

《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 5749—2006[17]中對(duì)金屬汞的限定值為0.001 mg/L，《漁類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》GB 11607—1989[18]中對(duì)汞的限定值更嚴(yán)，為0.000 5 mg/L。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，0.000 5 mg/L的汞濃度脅迫銅綠微囊藻25 min后，銅綠微囊藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度減小，相對(duì)熒光強(qiáng)度為負(fù)值。但田程的研究發(fā)現(xiàn)，用該濃度脅迫銅綠微囊藻，在4 h時(shí)熒光信號(hào)增強(qiáng)，而96 h時(shí)藻液熒光信號(hào)減弱，對(duì)藻的生長(zhǎng)和光合作用有不明顯的抑制作用[7]。Hg2+質(zhì)量濃度為0.050 mg/L時(shí)，短時(shí)間內(nèi)使銅綠微囊藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度增大，對(duì)藻的光合作用有不明顯的抑制作用，在24 h刺激銅綠微囊藻葉綠素a的合成[12]。這說(shuō)明Hg對(duì)銅綠微囊藻的毒性作用不單隨濃度的變化而變化，與響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短也有一定關(guān)系。當(dāng)Hg2+質(zhì)量濃度為0.500 mg/L時(shí)，其相對(duì)葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度小于0.400 mg/L Hg2+處理組，藻細(xì)胞體積增大，說(shuō)明藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化?？赡芤?yàn)殡SHg2+濃度與響應(yīng)時(shí)間的變化，影響銅綠微囊藻生理變化的作用途徑有所不同，這還需要進(jìn)一步的研究。

圖4也表明在短時(shí)間(25 min)內(nèi)銅綠微囊藻的濃度與Hg2+質(zhì)量濃度無(wú)關(guān)。在0.000 5～0.400 mg/L Hg2+的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，銅綠微囊藻在680 nm處的光密度不隨Hg2+質(zhì)量濃度的增大而變化，均為0.400左右。說(shuō)明短時(shí)間內(nèi)，Hg2+在0.000 5～0.400 mg/L范圍內(nèi)未對(duì)銅綠微囊藻的濃度產(chǎn)生影響。

3 結(jié) 論

利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)，通過(guò)在銅綠微囊藻中添加HgCl2溶液，測(cè)定銅綠微囊藻在435 nm/680 nm處的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化來(lái)研究銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈱?duì)Hg2+毒性的最佳響應(yīng)時(shí)間，以及不同濃度的Hg2+在最佳響應(yīng)時(shí)間內(nèi)對(duì)銅綠微囊藻的影響。結(jié)果表明，銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈱?duì)Hg2+毒性的最佳響應(yīng)時(shí)間為25 min，實(shí)驗(yàn)條件為溫度20～30 ℃，銅綠微囊藻的初始藻液濃度OD值大于1.400。當(dāng)Hg2+質(zhì)量濃度為0.000 5 mg/L時(shí)，銅綠微囊藻的相對(duì)熒光強(qiáng)度為負(fù)值；當(dāng)Hg2+質(zhì)量濃度為0.001～0.500 mg/L時(shí)，藻液的相對(duì)熒光強(qiáng)度大于零，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.001～0.400 mg/L)相對(duì)熒光強(qiáng)度與Hg2+質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，回歸方程為y=23.699x-0.249，r=0.983 3。

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