馮佳彩，齊國(guó)娣，劉 毅，楊毅華，劉守信

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

RGD即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列，它能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與細(xì)胞表面的整合素受體特異性結(jié)合從而參與多種生物學(xué)過程[1-3]，如在內(nèi)皮細(xì)胞的識(shí)別、眼科診治、生物傳感、抗血栓、抗血凝、抗腫瘤等方面都具有重要的作用。目前，人們對(duì)于RGD肽的研究已經(jīng)從抗血小板凝聚側(cè)重到抑制腫瘤細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤新血管生成等方面[4-5]。但RGD在體內(nèi)易于降解而不可作為藥物，為此相關(guān)結(jié)構(gòu)的改造一直是研究熱點(diǎn)之一。

關(guān)于RGD合成已報(bào)道了多種方法[6-11]，但作為一藥效團(tuán)與不同分子片段組裝時(shí)，碳端和氮端不同保護(hù)基的脫除涉及較多反應(yīng)，從而導(dǎo)致收率不高，甚至副產(chǎn)物嚴(yán)重。本研究在RGD三肽序列與環(huán)肽進(jìn)行化學(xué)組裝中，研究了天冬氨酸殘基為β-芐酯的氮端全由Cbz保護(hù)的RGD的合成方法，從而為組裝完成后用H2/Pd-C一次實(shí)現(xiàn)脫保護(hù)奠定了基礎(chǔ)，簡(jiǎn)化了整個(gè)合成過程。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

所用試劑和溶劑均為分析純，氨基酸為工業(yè)級(jí)，均為S構(gòu)型；柱層析硅膠0.076～0.150 mm(100～200目)，青島海洋化工有限公司生產(chǎn)；薄層層析用GF254薄層預(yù)制板，2.5 cm×7.5 cm，青島海洋化工有限公司生產(chǎn)，中國(guó)科學(xué)院上海藥物所監(jiān)制。

氨基酸氨基的Boc保護(hù)和脫保護(hù)采用文獻(xiàn)方法；1H NMR 和13C NMR用瑞士Bruker Avance 500 MHz核磁共振波譜儀記錄；質(zhì)譜用美國(guó)瓦里安500-MS離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀來采集。

1.2 RGD-OH的合成

RGD-OH的合成路線見圖1。

圖1 RGD-OH的合成路線Fig.1 Synthesis route of RGD-OH

1.2.1 Boc-Asp(OBzl) 的合成[12-14]

在500 mL圓底瓶中加入80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)H2SO40.1 mol，冰浴冷卻，加入天冬氨酸13.3 g (0.1 mol)，芐醇10.8 g (0.1 mol)。于65 ℃，15 mmHg條件下減壓反應(yīng)分水6 h。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，得淡黃色油狀物。加入乙酸乙酯350 mL，并用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0。將水相在42 ℃旋蒸至沉淀析出，置冰箱中冷藏過夜，抽濾。粗產(chǎn)物經(jīng)EtOH/H2O混合溶劑重結(jié)晶，得白色粉末Asp(OBzl) 16.1 g，熔點(diǎn)為221 ℃，產(chǎn)率為72%。將產(chǎn)物進(jìn)一步與Boc2O反應(yīng)，得白色粉末Boc-Asp(OBzl)20.2 g，熔點(diǎn)為99～101 ℃，產(chǎn)率為87%。

1.2.2 Cbz-Arg(Cbz)2的合成

將1.74 g (10 mmol)的L-精氨酸、80 mL二氯甲烷加入到250 mL的兩口瓶中，然后加入10.5 mL(60 mmol) DIPEA，于冰浴中滴加7.7 mL (60 mmol) TMS-Cl，室溫反應(yīng)2 h。隨后于0 ℃再加入10.5 mL (60 mmol) DIPEA，在攪拌的同時(shí)滴加6.4 mL (45 mmol)Cbz-Cl，繼續(xù)攪拌20 min后，于室溫反應(yīng)4 h。反應(yīng)液用鹽酸調(diào)pH值至2～3，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液3次，合并有機(jī)相，水洗。用無水MgSO4干燥。過濾，濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)乙醚重結(jié)晶，得淺桔黃色固體Cbz-Arg(Cbz)24.9 g，熔點(diǎn)為137～140 ℃，產(chǎn)率為85%。

1.2.3 Asp(OBzl)-OAllyl (1)的合成[15-17]

將3.23 g (10 mmol) Boc-Asp(OBzl)，27 mL DMF，2.76 g (24 mmol) 無水碳酸鉀加入干燥的三口燒瓶中，冰浴至0 ℃下，滴加烯丙基溴1.3 mL (15 mmol)，控溫反應(yīng)1 h后，室溫反應(yīng)過夜。過濾，減壓濃縮。于殘液中加入乙酸乙酯，分別用1 mol/L的 KHSO4水溶液洗(20 mL×2)、鹽水洗(30 mL×2)、飽和碳酸氫鈉溶液洗(30 mL×2)、飽和食鹽水洗 (30 mL×2)，再用無水MgSO4干燥，過濾，濃縮，得對(duì)應(yīng)天冬氨酸烯丙酯無色油狀液滴3.45 g，產(chǎn)率為95%。將產(chǎn)物進(jìn)一步用40%(體積分?jǐn)?shù))的TFA/CH2Cl2在室溫下處理1 h，即得化合物(1)黃色油狀液滴2.42 g，產(chǎn)率為97%。

1.2.4 Gly-Asp(OBzl)-OAllyl (2)的合成

將0.42 g (2.4 mmol) Boc-Gly與0.53 g (2 mmol) Asp(OBzl)-OAllyl加入到盛有50 mL二氯甲烷和5 mL DMF溶液的100 mL單口瓶中，攪拌溶解，然后分別加入HBTU 0.9 g (2.4 mmol)，DIPEA 1.8 mL (10 mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液旋蒸濃縮，殘余物中加入100 mL水，并用乙酸乙酯萃取(30 mL×3)。合并有機(jī)相，分別水洗(20 mL×2)，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))K2CO3水溶液洗(20 mL×2)，2%(體積分?jǐn)?shù))HCl水溶液洗(20 mL×2)，水洗(20 mL×2)及飽和食鹽水洗(20 mL×2)，用無水MgSO4干燥。過濾，濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)= 5∶1混合液作為洗脫劑)，即得無色油狀液滴Boc-Gly-Asp(OBzl)-OAllyl 0.78 g，產(chǎn)率為93%。1H NMR (500 MHz, CDCl3)，δ：1.45(s, 9H, —CO—O—C(CH3)3), 2.91(dd,J=17，4.5 Hz,1H, AspCβH—), 3.08(dd,J=17，4.5Hz,1H, AspCβH—), 3.80(d, 2H, GlyCαH2—), 4.59 (d,J=6, 2H,—CH2CH=CH2), 4.89～4.92(m, 1H, AspCαH—), 5.11(d,J=5, 2H,—CH2C6H5), 5.20～5.30(m, 2H,—CH2CH=CH2), 5.78～5.86(m,1H,—CH2CH=CH2), 7.12(s, 1H,—NHCOCH2—), 7.32～7.37(m, 5H,—CH2C6H5);13C NMR (500 MHz, CDCl3)，δ：28.33, 28.34, 28.35, 36.36, 44.18,48.61, 66.47, 66.91, 80.23, 118.92,128.28, 128.34, 128.43, 128.67, 128.73,131.43, 135.41, 155.99, 169.49, 170.16, 170.69。ESI-MS,m/z:421.2[M+H]+。

將所得產(chǎn)物進(jìn)一步用40%(體積分?jǐn)?shù))的TFA/CH2Cl2在室溫下處理1 h[16]，即得化合物(2)黃色油狀液滴0.58 g，產(chǎn)率為97%。

1.2.5 Cbz-Arg(Cbz)2-Gly-Asp(OBzl)-OAllyl (3)的合成

將0.69 g (1.2 mmol) Cbz-Arg(Cbz)2，0.32 g(1 mmol) Gly-Asp(OBzl)- OAllyl加入到盛有25 mL DCM和2.5 mL DMF溶液的100 mL單口瓶中，攪拌溶解，隨后分別加入HBTU 0.45 g (1.2 mmol)和DIPEA 0.9 mL (5 mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。減壓旋蒸除去溶劑，殘余物中加入100 mL水，并用乙酸乙酯萃取 (30 mL×3)。合并有機(jī)相，分別用水(20 mL×2)，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))K2CO3(20 mL×2)，2%(體積分?jǐn)?shù))HCl(20 mL×2)、水(20 mL×2)及飽和食鹽水 (20 mL×2)洗滌，用無水MgSO4干燥。過濾，濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，即得產(chǎn)物(3)白色固體0.82 g，熔點(diǎn)為167～170 ℃，產(chǎn)率為93%。1H NMR (500 MHz, DMSO)，δ：1.60～1.64(m, 4H, ArgCβH2+ArgCγH2)，2.76(dd,J=6.5,1H，AspCβH-)，2.87(dd,J=7, 1H，AspCβH-)，3.71～3.72(m, 2H，ArgCδH2)，3.83～3.86(m, 2H，GlyCαH2—)，3.98～4.00(m, 1H, ArgCαH2—)，4.53(d,J=5, 2H,—CH2CH=CH2)，4.72～4.76(m, 1H, AspCαH—)，4.99(s, 2H,—CH2C6H5)，5.04(s, 2H,—CH2C6H5)，5.09(s, 2H,—CH2C6H5)，5.22(s, 2H,—CH2C6H5)，5.16～5.29(m, 2H,—CH2CH=CH2)，5.82(m, 1H, —CH2CH=CH2)，7.28～7.40(m,20H,—CH2C6H5)，7.47(d,J=8, 1H, —OCONHCH—), 8.16(t,J=5.5,1H,—C=NH), 8.32(d,J=8, 1H,—CHNHCO—), 9.13～9.14(m, 1H,—CH2NHCO—)；13C NMR (500 MHz, DMSO)，δ：25.01, 28.93, 35.79, 41.63, 44.29, 48.44, 54.50, 65.19, 65.47, 65.88, 66.10, 68.15, 117.75, 127.63, 127.64, 127.68, 127.69, 127.76, 127.77, 127.79, 127.80, 127.88, 127.89, 128.02, 128.03, 128.21, 128.22, 128.30, 128.31, 128.38, 128.39, 128.48, 128.49, 132.04, 135.26, 135.76, 136.82, 137.06, 154.94, 156.05, 159.66, 162.86, 168.72, 169.70, 170.08, 172.02。ESI-MS,m/z: 879.4[M+H]+。

1.2.6 Cbz-Arg(Cbz)2-Gly-Asp(OBzl)-OH(4)的合成

在100 mL四口瓶中加入0.53 g (0.6 mmol) 化合物(3)、10 mL三氯甲烷和0.4 mL (3.6 mmol)N-甲基嗎啉，攪拌下使固體溶解，再加入0.277 g (0.24 mmol)Pd(PPh3)4。于氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，室溫反應(yīng)12 h。減壓旋蒸除去溶劑，加乙酸乙酯溶解，分別用1 mmol/L的 KHSO4水溶液(20 mL×2)、水(20 mL×2)、飽和食鹽水(20 mL×2)洗滌，無水MgSO4干燥。過濾，濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，即得產(chǎn)物(4)白色或淺黃色固體 0.45 g，熔點(diǎn)為109～112 ℃，產(chǎn)率為90 %。1H NMR (500 MHz, DMSO)δ：1.48～1.64 (m, 4H, ArgCβH2+ArgCγH2), 2.69～2.74(m, 1H, AspCβH-), 2.82～2.87(m, 1H, AspCβH-), 3.72～3.73(m, 2H, ArgCδH2), 3.73～3.86(m, 2H，GlyCαH2-), 4.01～4.06(m, 1H, ArgCαH2-), 4.64～4.68(m, 1H, AspCαH-), 5.00(s, 2H,—CH2C6H5), 5.05(s, 2H, -CH2C6H5), 5.10(s, 2H, —CH2C6H5), 5.23(s, 2H,-CH2C6H5), 7.28～7.41(m, 20H, -CH2C6H5);13C NMR (500 MHz, DMSO)，δ：25.55, 25.47, 36.49, 42.17, 44.82, 48.93, 55.01, 65.97, 66.23, 66.60, 68.64, 128.16, 128.17, 128.24, 128.27, 128.28, 128.31, 128.37, 128.38，128.43, 128.70, 128.76, 128.77, 128.79, 128.85, 128.86, 128.87, 128.98, 129.17, 129.18，129.27，135.79, 136.41, 137.36, 137.58, 155.43, 156.53, 160.17, 163.37, 169.02, 170.43, 172.42, 172.46。ESI-MS,m/z: 839.5[M+H]+。

2 結(jié)果與討論

在Asp(OBzl) 制備時(shí)，反應(yīng)溫度不能高于75 ℃，否則可能導(dǎo)致芐醇脫水生成芐基醚和天冬氨酸聚合等副反應(yīng)的發(fā)生，從而使產(chǎn)物顏色加深，收率低。旋蒸脫水不能濃縮過度，否則重結(jié)晶就難以達(dá)到理想效果。

對(duì)精氨酸胍基的保護(hù)在整個(gè)合成中是關(guān)鍵。如果先用Boc將氨基保護(hù)，形成Boc-Arg后再與Cbz-Cl反應(yīng)實(shí)現(xiàn)胍基的保護(hù)，會(huì)在接下來二肽的合成中易發(fā)生分子內(nèi)環(huán)合。為了避免這種副反應(yīng)的發(fā)生，在合成中先用TMS活化精氨酸分子中的胍基和氨基，在過量Cbz-Cl存在下實(shí)現(xiàn)精氨酸氨基和胍基同時(shí)保護(hù)，形成3個(gè)Cbz保護(hù)的精氨酸Cbz-Arg(Cbz)2?；衔?4)Cbz-Arg(Cbz)2-Gly-Asp(OBzl)的結(jié)構(gòu)中僅留有1個(gè)游離的羧基，不僅提供了與包括環(huán)肽在內(nèi)的其他活性分子進(jìn)行化學(xué)組裝的活性位點(diǎn)，還為組裝成功后脫除保護(hù)基過程的簡(jiǎn)化創(chuàng)造了有利的條件，具有良好的實(shí)用性。

3 結(jié) 語

合成了Cbz-Arg(Cbz)2對(duì)于精氨酸作為氨基端位的鏈肽的合成具有極其重要的意義，有利于最終一次性脫除其保護(hù)基，方法簡(jiǎn)便、高效；合成了Cbz 全保護(hù)RGD-OH，Cbz-Arg(Cbz)2-Gly-Asp(OBzl)，為后續(xù)研究工作奠定了基礎(chǔ)，具有重要意義。

參考文獻(xiàn)/References：

[1] ALMA D P. Novel tumor-targeted RGD peptide-amptothecin conjugates: Synthesis and biological evaluation[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010, 18: 64-72.

[2] TUCKER G C. Inhibitors of integrins[J]. Current Opinion in Pharmacology, 2002, 2(4): 394-402.

[3] GONCALVES R F, WOLINETZ C D, KILLIAN G J. Influence of arginine-glycine-aspartic acid (RGD), integrins (αVandα5) and osteopontin on bovine sperm-egg binding, and fertilization in vitro[J].Theriogenology, 2007, 67(3)：468-474.

[4] NEUS B P, MARTA G A, SERGIO L A, et al. Replacement of adenovirus type 5 fiber shaft heparan sulfate proteoglycan-binding domain with RGD for improved tumor infectivity and targeting[J].Human Gene Therapy, 2009, 20(10): 1 214-1 221.

[5] HUO Tianlong, DU Xiangke, ZHANG Sen. Gd-EDDA/HYNIC-RGD as an MR moleclar probe imaging integrin ανβ3receptor-expressed tumor-MR molecular imaging of angigenesis[J].European Journal of Radiology, 2010, 73(2): 420-427.

[6] 張 倩，張明智，張成海. RGD三肽液相合成的研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，33(6)：78-81.

ZHANG Qian, ZHANG Mingzhi, ZHANG Chenghai. Research on liquid-phase synthesis of RGD tripeptid[J]. Journal of Sichuan University, 2001, 33(6): 78-81.

[7] 宋明媚，鞠培培，曹建軍. 化學(xué)-酶法合成RGD三肽[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(5)：17-19.

SONG Mingmei, JU Peipei, CAO Jianjun. Chemical - enzymatic method on synthesis of RGD tripeptide [J]. Journal of Nanjing University of Technology, 2004, 26(5): 17-19.

[8] 劉麗艷，崔鳳俠，趙桂琴. 活性肽RGD的液相合成[J]. 化學(xué)試劑，2006，28(1)：55-56.

LIU Liyan, CUI Fengxia, ZHAO Guiqin. Liquid-phase synthesis of active RGD peptide[J]. Chemical Reagent, 2006, 28(1): 55-56.

[9] 楊大成，范 莉，鐘裕國(guó). 全保護(hù)RGD三肽的合成方法研究[J]. 有機(jī)化學(xué)，2003，23(5)：493-498.

YANG Dacheng, FAN Li, ZHONG Yuguo. Research on synthetic methods of all protected RGD tripeptide[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2003, 23(5): 493-498.

[10] PENG Shiqi, ZHAO Ming, MEI Shenghui, et al. Preparation Method and Application of Cortisone-RGD Peptide Conjugates[P].CN：103012553A, 2013-04-03.

[11] ZHOU Yiming, CUI Qi, CAI Huacheng. Process for Preparation of RGD Tripeptide[P]. CN：102336807A, 2012-02-01.

[12] 楊大成，范 莉.N-叔丁氧羰基-β-環(huán)己基天冬氨酸的合成[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2003，15(4)：498-500.

YANG Dacheng, FAN Li. Synthesis ofN-tert-butyloxycarboryl-β-cyclohexyl aspartic acid[J]. Chemical Research and Application, 2003, 15(4): 498-500.

[13] 鐘 飛，蔣曉惠，田敏卿，等.N-叔丁氧羰基-D-天冬氨酸-β-芐酯的合成[J].海南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，19(3)：243-245.

ZHONG Fei, JIANG Xiaohui, TIAN Minqing,et al.Synthesis ofN-tert-butyloxycarboryl-D-aspartic acid-β- benzyl ester[J]. Journal of Hainan Normal University, 2006, 19(3): 243-245.

[14] LASSEN K M, LEE J, JOULLIé M M. Synthetic studies of tamandarin B side chain analogues [J]. Journal of Organic Chemistry, 2010, 75(9): 3 027-3 036.

[15] YOKOKAWA F, INAIZUMI A, SHIOIRI T. Synthetic studies of the cyclic depsipeptides bearing the 3-amino-6-hydroxy-2-piperidone (Ahp) unit：Total synthesis of the proposed structure of micropeptin T-20[J]. Tetrahedron, 2005, 61(6): 1 459-1 480.

[16] HANESSIAN S, TREMBLAY M, MARZI M. Synthetic studies in the intramolecular carbocyclization ofN-acyloxyiminium ions：Stereoelectronic and steric implications of nucleophilic alkene, alkyne, and allene tethers[J].Journal of Organic Chemistry, 2005, 70(13): 5 070-5 085.

[17] 甄小麗，雷光華，韓金鑫，等.N-乙?；?L-脯氨酸-N-糖基修飾的絲氨酸二肽酯的合成與結(jié)構(gòu)解析[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32(2)：162-164.

ZHEN Xiaoli, LEI Guanghua, HAN Jinxin, et al. Synthesis and structural characterization ofN-acetyl-L-pro-N-glucopyranoside-L-ser didepsipeptide[J].Journal of Hebei University of Science and Technology , 2011, 32(2):162-164.