李明明，陳獻(xiàn)忠，周麗，沈微，樊游，王正祥

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院, 江蘇 無(wú)錫 214122

莽草酸是芳香族氨基酸和一些手性化合物合成的重要中間體[1]，本身具有眾多的生理功能和藥理作用，如通過(guò)影響花生四烯酸代謝來(lái)抑制血小板聚集，從而可以抑制動(dòng)、靜脈血栓及腦血栓形成；具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，是抗病毒和抗癌藥物的中間體[2]。此外，莽草酸是合成有效抗禽流感藥物-達(dá)菲的重要原料[3]。莽草酸途徑廣泛存在于細(xì)菌、子囊真菌、寄生蟲(chóng)和植物中[4-7]。

傳統(tǒng)的莽草酸生產(chǎn)方式主要有兩種：從八角屬植物的果實(shí)中提取[8]，或通過(guò)化學(xué)合成手段獲得。前者由于原材料的生長(zhǎng)受地域限制及氣候的影響，嚴(yán)重制約了莽草酸的大規(guī)模生產(chǎn)[9]；后者由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高也不能滿足莽草酸的大量需求。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)莽草酸在生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)工藝等方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。因此，通過(guò)代謝工程育種獲得高產(chǎn)莽草酸的微生物菌種并發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸具有廣闊的應(yīng)用前景。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵周期短以及易于分子操作等優(yōu)勢(shì)，是代謝工程育種中最常用的宿主。如圖1所示，大腸桿菌中莽草酸途徑是芳香族氨基酸合成的共同途徑，包含7步酶催化反應(yīng)，最終生成分支酸。首先由糖酵解途徑中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)和 HMP途徑的4-磷酸赤蘚糖 (E4P)縮合形成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸 (DAHP)起始，該反應(yīng)由aroF、aroG和aroH基因編碼的DAHP合成酶催化，這3個(gè)同工酶分別受到L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的反饋抑制[10]。PEP來(lái)自糖酵解途徑，也可由 ppsA基因編碼的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A催化丙酮酸轉(zhuǎn)化得到。tktA基因編碼的轉(zhuǎn)酮酶A是磷酸戊糖途徑中生成E4P的關(guān)鍵酶。DAHP經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)后生成代謝中間產(chǎn)物莽草酸，后者在莽草酸激酶的作用下生成莽草酸-3-磷酸 (S3P)，并最終合成 3種芳香族氨基酸。PEP和E4P是莽草酸合成的前體物質(zhì)，它們的合成和積累直接決定著莽草酸的合成能力。大量文獻(xiàn)表明，通過(guò)消除競(jìng)爭(zhēng)途徑，解除限速步驟或增強(qiáng)前體代謝產(chǎn)物的供應(yīng)，從而加強(qiáng)目的代謝產(chǎn)物的積累是微生物代謝工程常用的一種行之有效的方法[11]。

圖1 大腸桿菌莽草酸途徑Fig. 1 Pathway of shikimic acid in E. coli.

基于 Red重組系統(tǒng)的基因刪除技術(shù)是最近幾年來(lái)國(guó)際上進(jìn)行細(xì)菌代謝工程研究的常用方法之一。Red重組系統(tǒng)的原理是在來(lái)源于λ噬菌體的exo、bet、gam三個(gè)基因控制的重組酶的作用下，染色體DNA可以與外源線性DNA片段通過(guò)兩翼較短的同源序列高頻重組，使其整合到染色體上，并將染色體上的對(duì)應(yīng)序列置換下來(lái)[12]。本實(shí)驗(yàn)在Red重組系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌自身所含有的Xer重組酶能夠識(shí)別dif序列的特點(diǎn)[13]，運(yùn)用dif-dif重組將目的基因的兩端同源臂連接，從而去除了其中的抗性基因標(biāo)記。本研究中的基因刪除原理如圖2所示。

圖2 基因刪除流程Fig. 2 Schemes of gene inactivation approach.

為了有效利用大腸桿菌莽草酸途徑合成莽草酸，在分析大腸桿菌莽草酸代謝網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，首先利用Red-Xer重組系統(tǒng)刪除了莽草酸途徑中莽草酸激酶的編碼基因aroL和aroK，從而阻斷了莽草酸向莽草酸-3-磷酸的代謝反應(yīng)，提高了莽草酸的累積。通過(guò)刪除編碼 EIICBglc蛋白的ptsG基因部分阻斷了大腸桿菌依賴于PEP的葡萄糖過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)，使得細(xì)胞的葡萄糖運(yùn)輸主要依賴于半乳糖協(xié)同運(yùn)輸系統(tǒng)進(jìn)行[14]。為了減少副產(chǎn)物奎寧酸 (QA)的生成，進(jìn)一步刪除了 ydiB基因。最終獲得的大腸桿菌代謝工程菌的莽草酸合成和累積能力顯著提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

大腸桿菌Escherichia coli CICIM B0013由本中心篩選、保藏；E. coli JM109由本中心保藏；質(zhì)粒pKD46 (溫敏型復(fù)制子，含有阿拉伯糖啟動(dòng)子調(diào)控的gam、bet和exo基因，Ampr)由本中心保藏；質(zhì)粒 pSK-EcdifGm (含有 dif位點(diǎn)，Ampr，Gmr)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；pMD18-T-simple購(gòu)自TaKaRa (大連公司)。本實(shí)驗(yàn)所用到的大腸桿菌菌株見(jiàn)表1，本實(shí)驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表2。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

大腸桿菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基和質(zhì)粒增殖培養(yǎng)基LB (/L)：5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g NaCl；固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加 1.5%～2%的瓊脂粉。培養(yǎng)基中氨芐青霉素鈉和慶大霉素的終濃度分別為 100 μg/mL 和 30 μg/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (/L)：13 g Na2HPO4·H2O，3 g KH2PO4，0.5 g NaCl，0.1 g NH4Cl，1.2 g MgSO4，0.7 g L-苯丙氨酸，0.35 g L-色氨酸，0.7 g L-酪氨酸，0.3 g檸檬酸鐵銨，2.1 g一水合檸檬酸，0.01 g對(duì)羥基苯甲酸，0.01 g對(duì)氨基苯甲酸鉀，0.01 g 2,3-二羥基苯甲酸，15 g酵母抽提物，20 g蛋白胨，25 g葡萄糖。

dNTPs、Taq DNA聚合酶購(gòu)自上海華諾公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以及DNA片段快速膠回收試劑盒均購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa (大連)公司；L-阿拉伯糖購(gòu)自Sigma公司；引物合成及測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成；其余試劑均是國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的重組菌Table 1 Escherichia coli strains used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 利用Red-Xer重組系統(tǒng)刪除基因

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法[13,15]，分別進(jìn)行 aroL、aroK、ptsG和ydiB基因的刪除。

1.2.1 利用Red-Xer重組系統(tǒng)刪除aroL基因

用以 aroL基因上下游設(shè)計(jì)的引物 aLup和aLdn擴(kuò)增大腸桿菌染色體DNA上的aroL基因，片段大小為575 bp，PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T-simple載體中，獲得重組質(zhì)粒 pMD-aroL。以該重組質(zhì)粒為模板，用引物L(fēng)verp、Lverdn進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與difGm片段連接得到重組質(zhì)粒 pMD-aroL′::difGm。以重組質(zhì)粒pMD-aroL′::difGm 為模板，用第一組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到片段aroL′::difGm，即aroL基因的突變盒。

將aroL基因突變盒電擊轉(zhuǎn)入出發(fā)菌B0013/pKD46細(xì)胞后立即加入含有濃度為1 mmol/L的L-阿拉伯糖的液體LB培養(yǎng)基，30 ℃、100 r/min條件下后培養(yǎng)4～6 h，然后涂布于含有慶大霉素的抗性平板，利用引物YL、aLdn進(jìn)行菌落PCR鑒定獲得正確重組的轉(zhuǎn)化子并轉(zhuǎn)接于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)條件下多次轉(zhuǎn)接傳代后，劃線分離出單菌落并挑選出慶大霉素抗性丟失的轉(zhuǎn)化子，并用YL、aLdn引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.2 利用 Red-Xer重組系統(tǒng)刪除 aroK、ptsG和ydiB基因

與刪除aroL基因的方法相同，首先構(gòu)建aroK基因的突變盒。以aKup、aKdn為引物，利用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增大腸桿菌的aroK基因，PCR產(chǎn)物克隆入 pMD18-T-simple載體中，獲得重組質(zhì)粒 pMD-aroK。以上述重組質(zhì)粒為模板用引物Kverp和Kverdn，進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，并克隆入difGm片段得到重組質(zhì)粒pMD-aroK′::difGm。以重組質(zhì)粒 pMD-aroK′::difGm 為模板，用引物aKup和 aKdn進(jìn)行 PCR擴(kuò)增得到片段aroK′::difGm。將片段 aroK′::difGm 電轉(zhuǎn)入 SA1菌中進(jìn)行Red-Xer重組，實(shí)現(xiàn)aroK基因的突變。ptsG和ydiB基因刪除的技術(shù)路線同上。

1.3 搖瓶培養(yǎng)

將保藏在?70 ℃甘油管中的菌體劃線在固體平板上，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后接單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)9 h作為種子培養(yǎng)液。用種子培養(yǎng)液收集適量菌體，以發(fā)酵培養(yǎng)基重懸后在37 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)OD600，確定菌株生長(zhǎng)情況。用生物傳感儀測(cè)量發(fā)酵液中葡萄糖殘留量，從而確定菌體消耗葡萄糖的情況。為了防止在培養(yǎng)過(guò)程中菌體產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH降低從而影響菌體的生長(zhǎng)，可在培養(yǎng)過(guò)程添加適量的碳酸鈣進(jìn)行中和。本研究中所有發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，檢測(cè)數(shù)據(jù)取平均值進(jìn)行分析。

1.4 發(fā)酵及代謝物分析

細(xì)胞密度用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在 600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，細(xì)胞干重 (DCW) 是由 DCW 與OD600測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到，本實(shí)驗(yàn)所用菌株CICIM B0013的細(xì)胞干重 (DCW)與OD關(guān)系為：1 OD600=0.38 g/L DCW[16]。培養(yǎng)基中的葡萄糖用生物傳感儀 (SBA40C)(山東省科學(xué)院生物研究所)檢測(cè)。

莽草酸、奎寧酸、丙酮酸、以及乙酸和乳酸等有機(jī)酸用高效液相色譜分析。取1.5 mL的發(fā)酵上清液加入等體積的 10%的三氯乙酸混合均勻，4 ℃放置2 h沉淀雜質(zhì)蛋白 (測(cè)定胞內(nèi)有機(jī)酸時(shí)先用超聲波破碎細(xì)胞后按前述方法處理)，室溫12 000 r/min離心8 min，上清液經(jīng)0.45 μm的膜過(guò)濾后，用高效液相的方法測(cè)定發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物含量。

高效液相色譜分析條件：色譜柱為 Aminex HPX-87H column (300 mm×7.8 mm；9 μm)，流動(dòng)相為0.005 mol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為50 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，測(cè)量停留時(shí)間為20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因刪除

2.1.1 aroL基因的刪除與鑒定

首先用 1.2.1的方法構(gòu)建關(guān)鍵重組質(zhì)粒pMD-aroL′::difGm，該質(zhì)粒大小為4 057 bp，物理圖片如圖3A所示。將該重組質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得2.7 kb和1.3 kb左右的兩條電泳條帶，見(jiàn)圖3B。

圖3 重組質(zhì)粒 pMD-aroL’::difGm 的物理圖譜 (A)及酶切驗(yàn)證 (B)Fig. 3 Map of recombinant vector pMD-aroL′::difGm(A) and identification by restriction enzyme (B). 1:pMD-aroL’::difGm/EcoR I; M: DNA marker.

以重組質(zhì)粒pMD-aroL′::difGm為模板，PCR擴(kuò)增獲得aroL基因的突變盒aroL′::difGm，經(jīng)純化后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主菌 B0013/pKD46后涂布于慶大霉素抗性篩選平板上，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于無(wú)抗性的LB培養(yǎng)基平板上傳代培養(yǎng)，最后用引物YL、aLdn進(jìn)行菌落 PCR驗(yàn)證，原始菌株獲得aroL基因 (片段大小為 575 bp)，轉(zhuǎn)化子 SA1(aroL′::difGm)獲得片段 aroL′::difGm (大小為1.3 kb左右)，其慶大霉素抗性基因 (Gm)丟失后，轉(zhuǎn)化子SA1 (aroL′::dif)獲得大小為365 bp的aroL′::dif片段 (圖4)。表明aroL基因已經(jīng)被成功敲除。

2.1.2 aroK、ptsG和ydiB基因的刪除與鑒定

利用相似的策略刪除 aroK基因。首先構(gòu)建aroK刪除片段aroK′::difGm并將其電轉(zhuǎn)入宿主菌SA1/pKD46中。挑取轉(zhuǎn)化子后，用引物YK、aKdn進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，出發(fā)菌株 SA1獲得657 bp大小電泳圖譜；轉(zhuǎn)化子SA1 (aroK::difGm)獲得1.4 kb左右的電泳圖譜；其抗生素抗性基因丟失后，轉(zhuǎn)化子SA2獲得356 bp大小電泳圖譜(圖4)。即菌株SA1的aroK部分基因已被dif序列替換。

利用相似的策略進(jìn)行刪除 ptsG基因。首先構(gòu)建刪除片段ptsG′::difGm并將其電轉(zhuǎn)入宿主菌SA1/pKD46中。以引物YG和pGdn進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，ptsG基因的大小為1.4 kb，整合到染色體DNA上的ptsG′::difGm片段大小為1.7 kb，經(jīng)dif重組而丟掉Gm基因的轉(zhuǎn)化子SA3的PCR結(jié)果為0.5 kb (ptsG′::dif的大小)，鑒定電泳圖譜見(jiàn)圖4，表明ptsG基因已經(jīng)被成功敲除。

圖4 大腸桿菌基因刪除的PCR鑒定Fig. 4 Identification of genes knockout in E. coli. by PCR M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of aroL gene; 2:PCR product of aroL′::difGm; 3: PCR product of aroL′::dif; 4: PCR product of aroK gene; 5: PCR product of aroK′::difGm; 6: PCR product of aroK′::dif; 7: PCR product of ptsG gene; 8: PCR product of ptsG′::difGm; 9: PCR product of ptsG′::dif; 10: PCR product of ydiB gene; 11: PCR product of ydiB′::difGm; 12: PCR product of ydiB′::dif.

構(gòu)建用于刪除 ydiB基因的基因突變盒ydiB′::difGm并導(dǎo)入SA3細(xì)胞后，利用引物YB、yBdn進(jìn)行菌落 PCR驗(yàn)證。ydiB基因的大小為0.6 kb，ydiB基因片段的大小 1.3 kb左右，經(jīng)dif-dif重組而丟掉Gm基因的轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為0.3 kb左右 (ydiB′::dif的大小)。鑒定電泳圖譜見(jiàn)圖4，表明ydiB基因已經(jīng)被成功敲除。

2.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 代謝工程菌的細(xì)胞生長(zhǎng)和底物利用性能評(píng)價(jià)

分別考察出發(fā)菌 B0013和系列突變株(SA1、SA2、SA3和SA4)的細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖消耗和莽草酸合成情況。

由圖5可以看出，在發(fā)酵初期的4 h內(nèi)，突變株與對(duì)照菌株的生長(zhǎng)速度沒(méi)有顯著區(qū)別，但整個(gè)發(fā)酵周期來(lái)看代謝工程菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期顯著延長(zhǎng)，并且SA3和SA4菌株更為突出，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期達(dá)到了10 h。同時(shí)，表3表明，盡管出發(fā)菌株的比生長(zhǎng)速率高于代謝工程菌株，但出發(fā)菌株的最終的細(xì)胞生物量?jī)H為2.84 g/L，明顯低于其余4株基因缺失突變株，其中SA4菌株的最大生物量較高，達(dá)到了5.71 g/L。有趣的是，隨著基因的疊加刪除，突變株的SA1、SA2、SA3和SA4最大細(xì)胞生物量也呈現(xiàn)出依次升高的趨勢(shì)，分別達(dá)到3.45 g/L、3.94 g/L、5.24 g/L和5.71 g/L (圖5，表 3)。由此可見(jiàn)，基因刪除不僅影響大腸桿菌的細(xì)胞生長(zhǎng)性能，對(duì)最終細(xì)胞生物量也產(chǎn)生了明顯的影響。

圖5 大腸桿菌B0013及其基因缺失突變株的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程Fig. 5 Growth curve of B0013 and its SA-producing derivatives.

進(jìn)一步考察了突變株及對(duì)照菌株的底物利用情況，結(jié)果如圖6和表3所示。與突變株相比，出發(fā)菌株的葡萄糖利用速度最快，結(jié)合菌體生長(zhǎng)情況可以看出，出發(fā)菌株的細(xì)胞快速生長(zhǎng)可能是葡萄糖快速利用所引起的。與出發(fā)菌株相比，4株突變株在達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期以后葡萄糖消耗速度下降更為顯著，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，SA1菌株才基本利用完葡萄糖，而其余3株突變株的發(fā)酵液中均有不同程度的葡萄糖殘余，其中SA3菌株的發(fā)酵液中的殘余葡萄糖達(dá)到5 g/L左右。結(jié)合代謝工程菌的生長(zhǎng)性能可以看出，刪除莽草酸途徑中的aroK和aroL基因在一定程度上降低了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用速率，而 ptsG基因的刪除對(duì)抑制細(xì)胞的葡萄糖利用效率更為顯著。另一方面，發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和葡萄糖的快速利用對(duì)細(xì)胞的代謝活力要求較高，并且需要較高的溶氧水平。同時(shí)，分析了不同菌株發(fā)酵液的丙酮酸和乙酸 (數(shù)據(jù)未顯示)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株中的乙酸和丙酮酸等有機(jī)酸的含量明顯高于代謝工程菌，發(fā)酵液的pH相對(duì)較低，而SA2菌株的發(fā)酵液中丙酮酸水平顯著高于 SA3菌株，SA4發(fā)酵液中含有一定濃度的乙酸?？梢酝茰y(cè)，出發(fā)菌株的高生長(zhǎng)速率和低細(xì)胞生物量可能是由于培養(yǎng)過(guò)程中溶氧的限制導(dǎo)致有機(jī)酸的積累，從而限制了細(xì)胞后期的生長(zhǎng)，而 ptsG基因的刪除部分阻斷了PEP依賴型的PTS系統(tǒng)，使得細(xì)胞的葡萄糖利用效率降低，一方面導(dǎo)致了菌體的生長(zhǎng)緩慢，另一方面減少了PEP到丙酮酸的轉(zhuǎn)化。

圖6 大腸桿菌B0013及其基因缺失突變株的葡萄糖利用過(guò)程Fig. 6 Glucose consumption in B0013 and its SA-producing derivatives.

2.2.2 基因刪除對(duì)莽草酸及中間產(chǎn)物合成的影響

分別考察了突變株及其出發(fā)菌株的莽草酸合成能力，培養(yǎng)48 h后發(fā)酵液中的莽草酸含量最高，結(jié)果如圖7和表3所示。對(duì)照菌株B0013的莽草酸合成和累積水平最低，發(fā)酵液中幾乎檢測(cè)不到，說(shuō)明大腸桿菌的莽草酸代謝受到細(xì)胞的嚴(yán)格調(diào)控。通過(guò)刪除 aroL基因部分阻斷了莽草酸代謝的下游途徑后，菌株SA1莽草酸產(chǎn)量較出發(fā)菌有所提高，完全阻斷莽草酸激酶反應(yīng) (刪除aroL和aroK基因)，SA2發(fā)酵液中莽草酸含量達(dá)到67 mg/L。PEP作為莽草酸合成的前體，對(duì)細(xì)胞的莽草酸合成水平起著重要的調(diào)節(jié)作用，較高的 PEP前體可以有效提高目的產(chǎn)物的合成和積累。為考察PEP的累積對(duì)莽草酸的影響，在刪除aroL、aroK基因基礎(chǔ)上進(jìn)一步刪除了ptsG基因構(gòu)建了PTS部分缺失的突變株，該突變株主要利用葡萄糖協(xié)助蛋白和葡萄糖激酶組成的非 PEP供能的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，可以節(jié)約大量的 PEP用于莽草酸的合成。發(fā)酵結(jié)果顯示，突變株SA3的莽草酸合成能力顯著提高，發(fā)酵液中累積水平達(dá)到417 mg/L，相比于阻斷莽草酸激酶反應(yīng)，提高PEP前體對(duì)莽草酸合成和積累效果更為顯著。在突變株 SA3的基礎(chǔ)進(jìn)一步刪除了莽草酸/奎寧酸脫氫酶基因 (ydiB)，莽草酸最終產(chǎn)量達(dá)到576 mg/L，較出發(fā)菌株莽草酸產(chǎn)量為6 mg/L提高了90多倍。

同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn) ydiB基因的刪除能夠有效減少奎寧酸 (QA)合成和積累，發(fā)酵結(jié)束時(shí)SA3菌株的發(fā)酵液中QA的含量為128 mg/L，而敲除了 ydiB基因的 SA4突變株的 QA濃度僅為37 mg/L (表3)。由表3可知，盡管疊加刪除基因后的突變菌株較出發(fā)菌株的細(xì)胞生物量逐步提高，至最終重組菌SA4在發(fā)酵液中菌體濃度達(dá)到5.71 g/L，莽草酸的產(chǎn)量也顯著提高，但考慮到葡萄糖利用和發(fā)酵時(shí)間，莽草酸的產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度相對(duì)較低。

圖7 不同菌株莽草酸產(chǎn)量比較Fig. 7 Comparision of shikimic acid production comparison in different strains.

表3 搖瓶發(fā)酵參數(shù)比較Table 3 Comparison of parameters in shake-flask experiments

3 討論

本文通過(guò)連續(xù)刪除大腸桿菌的aroL、aroK、ptsG和ydiB等4個(gè)基因獲得了能夠合成積累一定濃度莽草酸的代謝工程菌株。通過(guò)刪除 aroL和 aroK基因能夠提高細(xì)胞的莽草酸積累水平，但是由于芳香族氨基酸是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的，因此必須向培養(yǎng)基中添加適量的3種芳香族氨基酸后才能保證突變株的正常生長(zhǎng)。ptsG基因刪除使得細(xì)胞的PTS系統(tǒng)部分缺失，導(dǎo)致了細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由PEP供能形式改變?yōu)锳TP供能形式，從而菌體前期由于沒(méi)有足夠的能量供給而生長(zhǎng)較慢，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，同時(shí)使得最終菌體濃度得到提高。另一方面，敲除 ptsG基因后，PTS系統(tǒng)并未完全失活，還存在著甘露糖依賴的EIIABCDMan系統(tǒng)，該葡萄糖運(yùn)輸途徑依然需要PEP的參與，同時(shí)大腸桿菌還存在非PTS系統(tǒng)的葡萄糖運(yùn)輸途徑 (如半乳糖:H+-葡萄糖激酶系統(tǒng)等)，但這些葡萄糖運(yùn)輸途徑的活性相對(duì)較低，也是導(dǎo)致葡萄糖代謝速率變慢，從而影響了底物利用效率和細(xì)胞生物量的原因之一[17]。更重要的是ptsG基因的缺失避免了PEP的過(guò)度消耗，為莽草酸合成和積累提供了更多的前體，因此能夠顯著提高細(xì)胞的莽草酸合成和積累能力?？鼘幩崾敲Р菟岷铣赏緩街械闹饕碑a(chǎn)物，該副產(chǎn)物的形成不僅降低了莽草酸的產(chǎn)量和得率，更重要的是給下游的莽草酸分離提取工藝帶來(lái)了較大的不便。刪除 ydiB基因不僅降低了副產(chǎn)物奎寧酸的生成，同時(shí)顯著提高了莽草酸的積累。

利用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)莽草酸成為近幾年來(lái)國(guó)際上解決莽草酸需求的熱點(diǎn)。事實(shí)上，微生物合成莽草酸的主要受限步驟是PEP和E4P的利用率[18]。自1885年，Eykman首次從莽草中分離出莽草酸以來(lái)，國(guó)際上對(duì)它的研究就一直沒(méi)有停止過(guò)[19]。Frost課題組針對(duì)大腸桿菌過(guò)量合成莽草酸的代謝工程開(kāi)展了系統(tǒng)研究，在刪除相關(guān)基因的基礎(chǔ)上過(guò)量表達(dá)glf、glk、aroFFBR、tktA和 aroE基因，獲得的代謝工程菌的莽草酸合成水平在10 L發(fā)酵罐中達(dá)到87 g/L，莽草酸得率為0.36 mol/mol[20]，這是迄今報(bào)道最高的莽草酸生產(chǎn)水平。楊婕等[21]在E. coli JM83的基礎(chǔ)上敲除aroL基因并游離表達(dá)了aroG、ppsA和tktA等3個(gè)基因，搖瓶水平下莽草酸產(chǎn)量達(dá)到 94 mg/L，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有利用代謝工程菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸的相關(guān)報(bào)道。本文構(gòu)建的代謝工程菌的莽草酸產(chǎn)量為568 mg/L，相比國(guó)外研究水平依然有很大差距。為了進(jìn)一步提高莽草酸產(chǎn)量，還可以進(jìn)行以下嘗試：一是通過(guò)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶基因提高細(xì)胞的莽草酸代謝能力；二是提高莽草酸上游代謝途徑的底物利用率；三是降低產(chǎn)莽草酸過(guò)程的副產(chǎn)物的形成。

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