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        保守的第52位色氨酸突變引起的胰高血糖素樣肽1受體N端片段活性喪失

        2013-11-12 02:21:18高蔚豐王娟
        生物工程學(xué)報(bào) 2013年1期
        關(guān)鍵詞:色氨酸噬菌體突變體

        高蔚豐,王娟

        寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,寧夏 銀川 750021

        胰高血糖素樣肽 1受體 (Glucogan-like peptide 1 receptor,GLP-1R)是 Drucher等于1987年在大鼠胰島瘤細(xì)胞RIN1046-38中發(fā)現(xiàn),屬于G蛋白耦聯(lián)受體B家族中的胰高血糖素樣受體亞家族[1]。該亞家族最明顯的特征是具有相對較長的胞外N端序列,通過3對二硫鍵形成一個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域,該區(qū)域在配體結(jié)合過程中起著關(guān)鍵作用[1-2]。胰高血糖素樣肽 1受體 N端片段(nGLP-1R)中形成3對二硫鍵的6個(gè)半胱氨酸是高度保守的。Aruna Bazarsuren等發(fā)現(xiàn),3對二硫鍵分別是由 C46與 C71、C62與 C104、以及 C85與C126形成[3]。還有文獻(xiàn)報(bào)道,nGLP-1R的6個(gè)色氨酸中,W72和 W110在 G蛋白耦聯(lián)受體家族中是高度保守的[4],將 W39、W72、W91、W110、W120分別突變?yōu)楸彼?(A)后,這些突變體都失去了與GLP-1結(jié)合的能力。但相反的是,將受體上的 W87突變?yōu)楸彼岷?,該突變體具有和野生型相同的親和能力,其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也很相似[5-6]。

        腸促胰島素類似物 (Exendin-4)的結(jié)構(gòu)與功能與胰高血糖素樣肽1 (Glucogan-like peptide 1,GLP-1)相似[7-12](與GLP-1有53%的氨基酸序列一致性),都是通過其中心域和 C末端與GLP-1R上的N末端域之間的相互作用實(shí)現(xiàn)其與GLP-1R的結(jié)合[13-14]。GLP-1與胰島素分泌和糖代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)[15],對 GLP-1R結(jié)構(gòu)和信號傳導(dǎo)機(jī)制的研究有助于了解其在糖尿病病理進(jìn)程中的作用,可望為糖尿病的治療提供新的方向[16-21]。目前,很多研究集中在配體[22-24]及受體片段與 GLP-1結(jié)合位點(diǎn)的研究[25]及受體胞內(nèi)跨膜結(jié)構(gòu)的研究上[26]。Exendin-4與nGLP-1R的結(jié)合能力比GLP-1更強(qiáng)[13],其結(jié)合位點(diǎn)存在差異??紤]到對nGLP-1R與Exendin-4的結(jié)合位點(diǎn)的不可知性,采用易錯(cuò)PCR (Error-prone PCR, epPCR)方法建立了一個(gè)鼠肺的不同長度nGLP-1R (從受體N端的第21個(gè)氨基酸開始到第145個(gè)氨基酸)的噬菌體隨機(jī)突變展示肽庫,然后利用Exendin-4篩選,以此來判斷是否某一段基因或兩段基因的缺失會影響到nGLP-1R與Exendin-4結(jié)合的活性。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        菌株大腸桿菌E. coli XL1-Blue、輔助噬菌體VSCM13和噬菌粒 Pfuse5為西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pET-28a(+)-GLP-1R為華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建;Exendin-4為華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行純化。pMD-18T載體試劑盒購自TaKaRa公司;小鼠抗 M13噬菌體酶聯(lián)單抗 Anti-M13-HRP monoclonal conjugate購自Amersham Pharmacia公司;限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶為 MBI公司產(chǎn)品;TMB顯色底物購自天根公司;胰化蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)XOID公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口的分析純。

        1.2 構(gòu)建 nGLP-1R的不同長度的易錯(cuò) PCR突變庫

        考慮到對nGLP-1R與Exendin-4的結(jié)合位點(diǎn)的不可知性,我們在以前工作的基礎(chǔ)上[27]根據(jù)nGLP-1R的基因序列設(shè)計(jì)了 2對引物,primer 11f-SfiⅠ從基因序列的第30個(gè)堿基開始,primer 21f-SfiⅠ從基因序列的第60個(gè)堿基開始,primer 11r-SfiⅠ則是到基因序列的第345位截止,primer 21r-SfiⅠ則是到基因序列的第 315位截止 (引物序列如表1所示)。以此來判斷是否某一段基因或兩段基因的缺失會影響到nGLP-1R與Exendin-4結(jié)合的活性。以pET-28a(+)-GLP-1R為模板,用引物 primer 1f-SfiⅠ作為上游引物,primer 1r-SfiⅠ、primer 11r-SfiⅠ、primer 21r-SfiⅠ分別作為下游引物;primer 11f-SfiⅠ作為上游引物,primer 1r-SfiⅠ、primer 11r-SfiⅠ、primer 21r-SfiⅠ分別作為下游引物;primer 21f-SfiⅠ作為上游引物,primer 1r-SfiⅠ、primer 11r-SfiⅠ、primer 21r-SfiⅠ分別作為下游引物,通過兩輪易錯(cuò)PCR擴(kuò)增9段長度不同的片段。

        表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

        1.3 GLP-1受體N端片段噬菌體突變庫的擴(kuò)增、富集和滴度測定

        噬菌體的擴(kuò)增、富集及滴度測定參考文獻(xiàn)[28]進(jìn)行。以固定于 96孔板孔中的 50 μg/mL的Exendin-4對nGLP-1R的隨機(jī)突變庫進(jìn)行了3輪親和篩選。

        1.4 單克隆噬菌體的制備

        從富集過程中用于計(jì)數(shù)的平板上隨機(jī)挑取20個(gè)單菌落,分別接種于10 mL SB (30 g/L 胰化蛋白胨,20 g/L 酵母提取物,10 g/L MOPS,40 μg/mL四環(huán)素,100 μg/mL氨芐青霉素,pH 7.0)中進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增后的噬菌體滴度調(diào)至1.0×1012PFU/mL。

        1.5 噬菌體的ELISA檢測

        在 96孔板的每孔中加入 50 μL Exendin-4(50 μg/mL),4 ℃包被過夜;清洗后,加入含脫脂奶粉的 TBST溶液 (50 mol/L Tris,150 mmol/L NaCl,40 g/L脫脂奶粉,pH 7.5),37 ℃封閉1 h后雙蒸水洗5次;加入50 μL單克隆噬菌體上清 (1.0×1012PFU/mL),37 ℃孵育2 h,充分洗滌;加入用含40 g/L脫脂奶粉的TBST按1∶1 000的比例稀釋的小鼠抗M13噬菌體酶聯(lián)單抗50 μL,37 ℃反應(yīng)1 h,充分洗滌;TMB顯色15 min后,以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),測OD455值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 nGLP-1R的不同長度突變體庫的構(gòu)建

        通過兩輪易錯(cuò)PCR擴(kuò)增9段長度不同的片段 (圖 1),構(gòu)建 nGLP-1R隨機(jī)突變體庫,經(jīng)平板計(jì)數(shù)測得的庫容量約為 9.6×107。對隨機(jī)挑選的30個(gè)突變體的測序結(jié)果表明,11個(gè)產(chǎn)生了移碼突變,5個(gè)存在顛換 (AT-TA),而每個(gè)突變體中至少有 2個(gè)堿基發(fā)生了突變,最多的則有 13個(gè)堿基產(chǎn)生了突變,這與文獻(xiàn)中報(bào)道的突變率大于2%的突變率范圍是相符合的[29]。

        2.2 nGLP-1R突變庫的親和篩選

        從對nGLP-1R的隨機(jī)突變庫的親和篩選結(jié)果(表2)看,第1輪篩選的產(chǎn)率大于(1.0×10?7)%,表明篩選過程中篩選方法、菌的生長狀態(tài)、感染過程或溶液均符合要求。隨著淘洗的進(jìn)行,產(chǎn)率逐漸升高,說明具有特異性結(jié)合能力的噬菌體通過篩選得到了較好的富集。

        2.3 nGLP-1R突變體結(jié)合Exendin-4活性的鑒定

        圖1 九段長度不同的nGLP-1R片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR products of nine nGLP-1R gene segments with different length. M: DNA marker; 1: 345 bp; 2:315 bp; 3: 285 bp; 4: 315 bp; 5: 285 bp; 6: 255 bp; 7:375 bp; 8: 345 bp; 9: 315 bp.

        表2 nGLP-1R噬菌體隨機(jī)突變肽庫的篩選Table 2 Enrichment of nGLP-1R phage randomly mutated library by biopanning

        從生物富集時(shí)用于計(jì)數(shù)的平板上隨機(jī)挑選了30個(gè)單菌落,用ELISA法測定了噬菌體上清與Exendin-4的結(jié)合活性。結(jié)果顯示,大部分噬菌體都具有一定的與Exendin-4結(jié)合的活性。但其中有一株 EP16與野生型 nGLP-1R (wt nGLP-1R)相比沒有活性,通過測序發(fā)現(xiàn),EP16長度為95個(gè)氨基酸,缺失了前面的20個(gè)和后面的10個(gè)氨基酸,并且第52位色氨酸突變?yōu)榱司彼?。為了更好地確定EP16與Exendin-4無結(jié)合活性,使用引物primer 21f-SfiⅠ和primer 11r-SfiⅠ構(gòu)建了野生型EP16 (wtEP16),使用重疊PCR法構(gòu)建第 52位色氨酸突變?yōu)榫彼岬娜LnGLP-1R (nGLP-1RW52R),以質(zhì)粒 pET-28a(+)-GLP-1R為模板,以primer 1f-SfiⅠ為上游引物,E52 reverse (5¢-catctggccagcaggcgtagtca-3¢)為下游引物擴(kuò)增出 nGLP-1R的前半段基因序列;以引物 E52 forward (5¢-tgactacgcctgctggccagat-3¢)為上游引物,primer 1r-SfiⅠ為下游引物擴(kuò)增出nGLP-1R的后半段基因序列;以這兩段基因序列為模板,primer 1f-SfiⅠ和 primer 1r-SfiⅠ為引物,通過重疊延伸PCR法,改變wtnGLP-1R中的第52位氨基酸序列。以輔助噬菌體VSCM13作為陰性對照,利用3次獨(dú)立的ELISA試驗(yàn)對其結(jié)合活性進(jìn)行驗(yàn)證 (表3)。結(jié)果顯示,wtEP16結(jié)合 Exendin-4的活性與 wtnGLP-1R相當(dāng),nGLP-1RW52R沒有結(jié)合Exendin-4的活性。

        2.4 EP16突變體氨基酸序列分析

        對篩選得到的EP16突變體的氨基酸序列分析 (圖2)顯示,EP16中有1個(gè)氨基酸發(fā)生突變:第52位色氨酸 (W)突變?yōu)榫彼?(R),且缺失了前20個(gè)和后10個(gè)氨基酸。

        由于EP16既有缺失又有突變,所以在無法確定其活性的喪失是由于突變造成還是由于缺失部分氨基酸造成的情況下,構(gòu)建了wtEP16及nGLP-1RW52R來進(jìn)行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn) wtEP16是有結(jié)合 Exendin-4活性的,nGLP-1RW52R沒有結(jié)合Exendin-4的活性 (表3)。由此說明,突變體EP16無活性是由于其第52位色氨酸突變?yōu)榫彼岫鸬?。EP16失去結(jié)合Exendin-4的活性可能是由于以下原因:1)色氨酸是非極性氨基酸,在突變?yōu)闃O性帶正電的精氨酸后,可能會對nGLP-1R的整個(gè)肽鏈的極性產(chǎn)生影響,從而影響到受體的折疊構(gòu)象使得受體與配體Exendin-4間的交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生變化。2)色氨酸是雜環(huán)族氨基酸,其環(huán)上帶有咪唑環(huán),而精氨酸是脂肪族氨基酸。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,W39突變?yōu)楸彼?A)后,nGLP-1R失去了結(jié)合 GLP-1的能力[5]。由此可以推斷,氨基酸殘基上有無咪唑基團(tuán)可能也會在很大程度上影響整個(gè)肽鏈結(jié)合 Exendin-4的活性。

        由于Exendin-4與N端片段的結(jié)合活性要比GLP-1與N端片段的結(jié)合活性強(qiáng),那么可以猜測其結(jié)合位點(diǎn)也是有所差別的,在wtEP16中,W39的缺失沒有影響exendin-4與受體N端片段的結(jié)合。但 EP16則由于其第 52位 (文獻(xiàn)[6]中的第72位氨基酸)氨基酸由W突變成了R而喪失了活性,那么可以推測,對于nGLP-1R來說,其與GLP-1的結(jié)合需要除W87外5個(gè)W的參與,但在nGLP-1R與Exendin-4作用時(shí),W39的存在與否并不會影響到nGLP-1R與Exendin-4的結(jié)合,而W72(在本文中為第52位氨基酸)的突變則會影響到它們的結(jié)合。這個(gè)結(jié)果顯示,W72對受體N端片段與Exendin-4的結(jié)合的影響要大于W39。

        表3 ELISA方法檢測噬菌體突變體EP16和野生型EP16結(jié)合Exendin-4的活性Table 3 Binding activity of the mutant EP16 and wtEP16 to Exendin-4 analyzed by ELISA

        圖2 突變體EP16、野生型EP16、nGLP-1RW52R與野生型nGLP-1R的氨基酸序列的比較Fig. 2 Comparison of amino acid sequence between mutant EP16, wtEP16, nGLP-1RW52R and wtnGLP-1R.

        3 結(jié)論

        胰高血糖素樣肽1受體N端片段在缺失了前20個(gè)和后10個(gè)氨基酸仍具有生物學(xué)活性,但第52位保守氨基酸色氨酸的突變引起了活性的喪失。因此證明了氨基酸殘基的極性改變及有無咪唑基因都有可能會影響整個(gè)肽鏈結(jié)合 Exendin-4的活性。而關(guān)鍵位點(diǎn)單個(gè)氨基酸殘基的突變可以改變 nGLP-1R整個(gè)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。GLP-1R因在胰島素分泌和血糖調(diào)節(jié)方面有重要作用,基于對GLP-1R結(jié)構(gòu)功能及其信號傳導(dǎo)通路的認(rèn)識,建立相應(yīng)的藥物篩選模型,尋找非肽類GLP-1R小分子激動劑,具有良好的科學(xué)價(jià)值和潛在的市場前景。本研究所建立的 nGLP-1R噬菌體隨機(jī)突變體庫能夠很好地應(yīng)用于受體-配體的結(jié)合研究,稍加改造即可成為一個(gè)高能量篩選非肽類GLP-1R小分子激動劑的方法。

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