趙婧，劉怡，李清艷，朱欣娜，張學(xué)禮

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 310018

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

3 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

β-胡蘿卜素屬于類胡蘿卜素家族的一員，在藥品、保健品、化妝品和食品上有廣泛的應(yīng)用[1-2]。盡管目前市場上銷售的 β-胡蘿卜素 90%是通過化學(xué)合成法獲得，但隨著國內(nèi)外對天然β-胡蘿卜素市場需求的增加，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。很多天然微生物都能合成β-胡蘿卜素，例如三孢布拉氏霉菌 Blakeslea trispora、成團(tuán)泛菌 Pantoea agglomerans等[4]。由于類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)基因已經(jīng)解釋清楚，大腸桿菌遺傳背景清晰、操作簡單，以大腸桿菌作為出發(fā)菌株，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建產(chǎn)類胡蘿卜素基因工程高產(chǎn)菌株，成為包括β-胡蘿卜素在內(nèi)的多種類胡蘿卜素產(chǎn)品開發(fā)的新生產(chǎn)途徑[1-3,5-6]。

異戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸酯 (DMAPP)是類胡蘿卜素來源的兩個(gè)通用前體。目前已知有兩種合成途徑：一種是甲羥戊酸 (Mevalonate)途徑MVA，主要存在于古生菌、真菌和植物的胞液或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上；另一種是 MEP(2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸)途徑，主要存在于細(xì)菌和植物質(zhì)體中[7](圖 1)。Yoon等進(jìn)行了MVA途經(jīng)合成β-胡蘿卜素的研究，他們將MVA途經(jīng)的下游3個(gè)基因和β-胡蘿卜素合成相關(guān)基因以質(zhì)粒形式在大腸桿菌表達(dá)，有效提高了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，在外源添加甲羥戊酸的情況下，產(chǎn)量達(dá)503 mg/L，單位細(xì)胞含量達(dá)49.3 mg/g干重細(xì)胞。但外源基因的高水平表達(dá)抑制了細(xì)胞的生長，并且存在重組細(xì)胞不穩(wěn)定的缺點(diǎn)[1-3]。多個(gè)研究小組采用了在染色體上用強(qiáng)啟動子調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)強(qiáng)度的策略來實(shí)現(xiàn)提高類胡蘿卜素生產(chǎn)的目的[2-5]。Yuan等為了鑒定MEP途經(jīng)的限速步驟，利用同源重組的方法，用T5啟動子在染色體上分別替換了MEP途徑的各基因的啟動子，發(fā)現(xiàn)調(diào)控dxs、idi、ispB、ispDF基因后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別提高了 100%、40%、20%和40%。用T5啟動子對這4個(gè)基因進(jìn)行組合調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了6.3倍，達(dá)到6 mg/g干重細(xì)胞。Suh用強(qiáng)啟動子T5調(diào)控MEP途經(jīng)的關(guān)鍵基因dxs、idi和ispDF后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量比對照提高了4.5倍[8]。

然而強(qiáng)啟動子對于獲得目的產(chǎn)物的最大代謝流量來說并不一定是最優(yōu)的[9]。Kim等在研究不同拷貝數(shù)質(zhì)粒表達(dá)外源基因?qū)Ψ鸭t素產(chǎn)量影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，低拷貝質(zhì)粒表達(dá)外源基因使重組大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量更高[10]。因此，代謝途徑中的基因應(yīng)該有一個(gè)最適的表達(dá)強(qiáng)度，從而避免因有毒代謝中間物的積累而導(dǎo)致的生長受限和產(chǎn)量下降[9-11]。使用人工調(diào)控元件文庫，特別是啟動子文庫，可以對代謝途徑中的基因進(jìn)行精確調(diào)控，從而獲得代謝途徑中基因的最適表達(dá)強(qiáng)度[11-14]。Alper等使用多個(gè)人工啟動子對 dxs基因進(jìn)行調(diào)控，鑒定出對于番茄紅素生產(chǎn)的最適表達(dá)強(qiáng)度[11]。Meynial-Salles等使用 3個(gè)人工啟動子對 3-磷酸甘油醛脫氫酶基因 (gapA)進(jìn)行調(diào)控，鑒定出對于甘油生產(chǎn)的最適表達(dá)強(qiáng)度[13]。

本研究中我們首先在大腸桿菌中引入 β-胡蘿卜素合成基因 crtEBIY，創(chuàng)建出 β-胡蘿卜素的合成途徑。然后用前期構(gòu)建的調(diào)控元件文庫中的6個(gè)不同強(qiáng)度的調(diào)控元件[15]對MEP途徑的7個(gè)基因 (圖 1，dxs，dxr，ispDF，ispE，ispG，ispH和idi)和FPP合成酶基因 (ispA)進(jìn)行調(diào)控，探索其對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，為實(shí)現(xiàn)MEP途徑各基因的最優(yōu)表達(dá)提供理論基礎(chǔ)和借鑒。

圖1 大腸桿菌中用于萜類化合物合成的 MEP途徑和引入的β-胡蘿卜素合成途徑Fig. 1 MEP pathway for isoprenoid biosynthesis in E. coli and heterologous β-carotene synthetic pathway.Abbreviation: G-3-P: glyceraldehyde-3-phosphate; DXP:1-deoxy-D-xylulose-50phosphate; MEP: 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate; CDP-ME: 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol; CDP-MEP: 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphate; MEC: 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate; HMBPP: 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate; IPP: Isopentenyl diphosphate; DMAPP: dimethylallyl diphosphate; GPP:geranyl diphosphate; FPP: farnesyl diphosphate; GGPP:geranylgeranyl diphosphate.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素，購自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；DNA回收試劑盒購自美國Biomiga公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶，DNA Marker trans2K，購自大連寶生物工程公司；限制性內(nèi)切酶PacⅠ、BamHⅠ、DpnⅠ、T4 DNA連接酶、快連酶、T4多聚核苷酸激酶購自NEB公司；胡蘿卜素標(biāo)品購自美國Sigma公司 (Cat. No. C4582)；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；電轉(zhuǎn)儀，MicroPulser；臺式高速離心機(jī)，Eppendorf 5415D；紫外可見分光光度計(jì)，Shimadzu UV-2550；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series 1200。

1.1.3 菌株

本研究所用菌株已經(jīng)在表1中列出。

表1 本研究所用的大腸桿菌菌株Table 1 Escherichia coli strains used in this work

續(xù)表1

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

每升LB培養(yǎng)基包括10 g胰蛋白酶蛋白胨，5 g酶酵母提取物和5 g氯化鈉；氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素終濃度分別為 100、34、50 μg/mL。

好氧培養(yǎng)：將保存于?80 °C的菌種在加有相應(yīng)抗生素的平板上活化，挑單菌落到4 mL LB試管中 (15 mm×100 mm)中，培養(yǎng)含 pTrc99AM-crt質(zhì)粒的菌株的培養(yǎng)基加氨芐青霉素，培養(yǎng)含pACYC184-M-crt質(zhì)粒的菌株的培養(yǎng)基加氯霉素，30 °C、250 r/min過夜培養(yǎng)，1%的接種量轉(zhuǎn)接到好氧培養(yǎng)基 (相應(yīng)的抗生素)中，30 °C、250 r/min培養(yǎng)。待生長2 h后，即OD600=0.1時(shí)，添加終濃度為1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG (異丙基-?-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)。在培養(yǎng) 22 h后，收集菌液用于β-胡蘿卜素產(chǎn)量的測量。

1.2.2 β-胡蘿卜素產(chǎn)量的檢測方法

通過測定丙酮萃取的β-胡蘿卜素在 453 nm下的吸收來確定β-胡蘿卜素產(chǎn)量[2]。取2 mL培養(yǎng)的菌液于14 000 r/min離心3 min，無菌水清洗后，用1 mL丙酮懸浮沉淀，在55 °C黑暗條件下萃取15 min，然后將樣品在14 000 r/min下離心10 min，將含有β-胡蘿卜素的上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。紫外分光光度計(jì)453 nm下測定β-胡蘿卜素吸收值，并計(jì)算其對細(xì)胞濁度 (OD600)的相對值，表示單位菌體β-胡蘿卜素的相對產(chǎn)量。除此之外，用高效液相色譜測定β-胡蘿卜素的絕對產(chǎn)量。檢測條件：VWD檢測器，Symmetry C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇：乙腈：二氯甲烷(21∶21∶8)，流速1.0 mL/min，柱溫30 °C，檢測波長450 nm。每個(gè)待測樣品分別有3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取自3個(gè)平行的平均值。用購自Sigma公司的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 表達(dá)外源胡蘿卜素基因的質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建用于表達(dá)外源胡蘿卜素基因的質(zhì)粒pTrc99A-M 和 pACYC184-M (圖 2)。以質(zhì)粒pTrc99A的DNA為模板，通過引物99A-F1-PacⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ/99A-R1-PacⅠ擴(kuò)增DNA片段1 (表2)，使得 PacⅠ、SpeⅠ和 NdeⅠ酶切位點(diǎn)位于pTrc99A質(zhì)粒lacI基因的前面，PacⅠ酶切位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄終止子rrnB的后邊。將片段1用DpnⅠ進(jìn)一步酶切，并用T4多聚核苷酸激酶磷酸化。以質(zhì)粒 pTrc99A的 DNA為模板，通過引物99A-F2/99A-R2擴(kuò)增DNA片段2 (表2)，DpnⅠ酶切，并在快連酶作用下與磷酸化的DNA片段1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 trans10感受態(tài)細(xì)胞，在含有終濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。挑選 5個(gè)克隆，提取質(zhì)粒 DNA，并用 PacⅠ、BamHⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。將正確的陽性克隆命名為pTrc99A-M。同樣的方法，以質(zhì)粒pACYC184的 DNA為模板，通過引物 184-F2/184-R2擴(kuò)增DNA片段3 (表2)，DpnⅠ酶切，并在快連酶作用下與磷酸化的DNA片段1連接，并用PacⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。將正確的陽性的克隆命名為pACYC184-M。

圖2 攜帶β-胡蘿卜素合成基因的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig. 2 Construction of plasmids containing carotenogenic genes for β-carotene production.

成團(tuán)泛菌Pantoea agglomerans中β-胡蘿卜素合成基因 (crtEXYIB)是成簇存在的[16]。因此以成團(tuán)泛菌CGMCC No. 1.2244的基因組DNA為模板，通過引物crt-cluster-f/crt-cluster-r擴(kuò)增β-胡蘿卜素合成基因操縱子 (crtEXYIB)(表2)，將純化后的crtEXYIB片段及pTrc99A-M質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和 SalⅠ雙酶切，在 T4 DNA連接酶的作用下16 ℃連接，得到質(zhì)粒pTrc99A-M-crt。同樣的方法，將該片段及pACYC184-M質(zhì)粒用PacⅠ酶切，純化回收，在 T4 DNA連接酶的作用下16 ℃連接，得到質(zhì)粒pACYC184-M-crt(圖 2)。

1.2.4 用不同的調(diào)控元件在大腸桿菌中對類異戊二烯基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控

用6個(gè)不同強(qiáng)度 (M1-12，M1-64，M1-30，M1-46，M1-37 and M1-93)的人工啟動子調(diào)控元件對大腸桿菌MEP途徑的7個(gè)基因 (包括dxs，dxr，ispDF，ispE，ispG，ispH，idi和 ispA)和ispA基因在染色體水平上進(jìn)行調(diào)控。相對于大腸桿菌中誘導(dǎo)后 lacZ啟動子，調(diào)控元件的強(qiáng)度M1-12、M1-64、M1-30、M1-46、M1-37和 M1-93分別是它的0.1、0.4、0.8、1.7、2.5和5倍[15]。按照Lu等描述的方法，通過一對通用引物，利用不同強(qiáng)度的調(diào)控原件調(diào)控每個(gè)基因的[15](圖3)。上游引物 gene-up-FRT，包括調(diào)控基因原始調(diào)控區(qū)域外的50個(gè)堿基和與FRT序列同源的20個(gè)堿基。下游引物為gene-RBS-down，包括和大腸桿菌lacZ基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)同源的15個(gè)堿基和待調(diào)控基因起始密碼子后的50個(gè)堿基 (圖3，表2)。對于dxs基因，使用dxs-up-FRT/dxs-RBS-down引物 (表 2)，以信使 RNA穩(wěn)定區(qū)文庫 1(M-Lib1)中的相應(yīng)重組菌株的基因組DNA擴(kuò)增DNA片段[15]，將片段電轉(zhuǎn)入含有pKD46的大腸桿菌MG1655感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板中過夜培養(yǎng)，挑選單克隆，用引物dxs-up-FRT/dxs-381-down進(jìn)行PCR驗(yàn)證(表2)。驗(yàn)證正確的克隆，將其命名為dxs-M1-12-FKF、dxs-M1-64-FKF、dxs-M1-30-FKF、dxs-M1-46-FKF、dxs-M1-37-FKF以及dxs-M1-93-FKF。采用同樣的方法調(diào)控其他基因，所用引物序列在表2中列出。為了在同一重組大腸桿菌中同時(shí)調(diào)控MEP途徑中的多個(gè)關(guān)鍵基因，根據(jù)Datsenko描述方法[17]去除 idi-M1-37-FKF中的 FRT-Km-FRT，得到idi-M1-37，然后按照上述一步調(diào)控方法用 M1-64和 M1-37啟動子調(diào)控 idi-M1-37的dxs基因。將質(zhì)粒pACYC184-M-crt 轉(zhuǎn)入所有調(diào)控過的重組菌株中，用于檢測β-胡蘿卜素產(chǎn)量。

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this work

續(xù)表2

圖3 用6種不同強(qiáng)度調(diào)控元件調(diào)控dxs基因表達(dá)的示意圖Fig. 3 Modulation of dxs gene expression with six artificial regulatory parts.

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

為了有效表達(dá)外源基因，本研究通過 PCR的方法，重新構(gòu)建了兩個(gè)表達(dá)載體pTrc99A-M和pACYC184-M，這兩個(gè)質(zhì)粒具有相同的啟動子和多克隆位點(diǎn)，具有不同的復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性基因和不同的拷貝數(shù)，利用這兩個(gè)質(zhì)?？梢杂行П容^相同條件下，不同拷貝數(shù)的外源基因?qū)δ繕?biāo)產(chǎn)物的影響。按照圖2所示構(gòu)建質(zhì)粒。

質(zhì)粒構(gòu)建成功后，限制性內(nèi)切酶PacⅠ分別酶切兩個(gè)質(zhì)粒，驗(yàn)證是否為正確連接。結(jié)果如圖4所示，pTrc99A-M經(jīng)PacⅠ酶切后得到大小為 1 771 bp和 1 978 bp的條帶(圖 4A)。pACYC184-M 經(jīng)限制性內(nèi)切酶 PacⅠ酶切的大小為1 978 bp和2 204 bp的條帶 (圖4 B)。結(jié)果與預(yù)期一致，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒pTrc99A-M和pACYC184-M的酶切鑒定Fig. 4 Identification of pTrc99A-M and pACYC184-M by restriction endonuclease digestion.(A)M: DNA marker trans2K; 1: pTrc99A-M; 2:pTrc99A-M digested with Pac I. (B)M: DNA marker trans2K; 1: pACYC184-M; 2: pACYC184-M digested with Pac I.

2.2 外源胡蘿卜素基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

大腸桿菌本身沒有合成β-胡蘿卜素的能力，但是引入crtEBIY基因后，大腸桿菌就可以生產(chǎn)β-胡蘿卜素[18]。按照圖 2所示，克隆成團(tuán)泛菌CGMCC No. 1.2244的β-胡蘿卜素合成基因操縱子，構(gòu)建 pTrc99A-M-crt和pACYC184-M-crt質(zhì)粒，用于生產(chǎn)β-胡蘿卜素。

重組質(zhì)粒pTrc99A-M-crt構(gòu)建成功后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切驗(yàn)證，得到大小分別為5 804 bp和3 716 bp的條帶 (圖5A)，且測序正確；重組質(zhì)粒pACYC184-M-crt經(jīng)限制性內(nèi)切酶PacⅠ酶切的大小為7 749 bp和2 204 bp的條帶 (圖5B)。結(jié)果與預(yù)期一致，并測序正確，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 不同質(zhì)粒對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

圖5 重組質(zhì)粒pTrc99A-M-crt和pACYC184-M-crt的酶切鑒定Fig. 5 Identification of pTrc99A-M-crt and pACYC184-M-crt by restriction endonuclease digestion.(A)M: DNA marker trans2K; 1: pTrc99A-M-crt digested with EcoR I and Sal I; 2: pTrc99A-M-crt. (B)M: DNA marker trans2K; 1: pACYC184-M-crt digested with Pac I; 2: pACYC184-M-crt.

因?yàn)?pTrc99A-M-crt和 pACYC184-M-crt拷貝數(shù)不同，對于 β-胡蘿卜素生產(chǎn)的影響必然不同。所以將這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655，以確定不同拷貝數(shù)對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。

結(jié)果表明 (圖6)，雖然 pTrc99A-M-crt的拷貝數(shù)比 pACYC184-M-crt高，但是當(dāng)大腸桿菌MG1655中含有pACYC184-M-crt質(zhì)粒時(shí)，產(chǎn)量是含pTrc99A-M-crt的大腸桿菌的1.69倍。說明并不是基因表達(dá)越高，產(chǎn)量就越高。Albermann等得到的類似研究結(jié)果，他們在研究番茄紅素基因的不同表達(dá)水平對番茄紅素產(chǎn)量的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)番茄紅素基因低水平表達(dá)，更有利于番茄紅素的產(chǎn)生[19]。

2.4 調(diào)控萜類合成途徑基因的表達(dá)來提高 β-胡蘿卜素產(chǎn)量

用 6個(gè)強(qiáng)度的人工調(diào)控元件，對大腸桿菌MG1655的MEP途徑的7個(gè)基因和ispA基因調(diào)控，將得到的菌株轉(zhuǎn)化 pACYC184-M-crt。1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)后，測定β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。結(jié)果表明，不同調(diào)控元件對8個(gè)基因進(jìn)行調(diào)控，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量發(fā)生了顯著的變化(圖 7)，每一個(gè)基因的最適調(diào)控強(qiáng)度也各不相同(圖 7和表 3)。

圖6 轉(zhuǎn)化不同拷貝數(shù)質(zhì)粒后β-胡蘿卜素產(chǎn)量的比較Fig. 6 Comparison of β-carotene production by MG1655 transformed with pACYC184-M-crt and pTrc99A-M-crt.

dxs和idi被認(rèn)為是類異戊二烯合成途徑中2個(gè)主要的限速步驟，所以增加這兩個(gè)酶的活性來提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量是一個(gè)通用的策略[17-20]。與之前的工作相符，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控dxs和idi基因比調(diào)控 dxr、ispDF、ispE、ispG和 ispH在提高 β-胡蘿卜素產(chǎn)量方面更為有效。用 M1-37調(diào)控元件調(diào)控dxs基因，使得β-胡蘿卜素的產(chǎn)量是野生菌的3.5倍，這也是所有調(diào)控過的菌株中效果最好的 (表3)。調(diào)控idi和ispA基因使得β-胡蘿卜素的產(chǎn)量有了中等程度的提高，是野生菌的2.1和 2.3倍 (表 3)。調(diào)控 dxr、ispDF、ispE、ispG和 ispH 基因后，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量是野生菌的1.2到1.4倍。我們也用HPLC檢測了β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高的菌株 (含有pACYC184-M-crt質(zhì)粒的 dxs-M1-37-FKF菌株)。結(jié)果表明 β-胡蘿卜素是單一的類胡蘿卜素化合物，產(chǎn)量為7.8 mg/g干重細(xì)胞。

表3 調(diào)控萜類合成途徑基因后β-胡蘿卜素的相對產(chǎn)量Table 3 Relative β-carotene production of engineered E. coli after modulating isoprenoid gene expression

Yuan等[2]的研究表明，用高強(qiáng)度的T5啟動子調(diào)控MEP途徑的dxs、ispDF、ispE和idi這4個(gè)基因時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別提高了 100%、40%、20%和40%；但用高強(qiáng)度的T5啟動子調(diào)控dxr、ispG和ispH基因時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量反而下降了。本研究使用了6個(gè)具有不同強(qiáng)度的人工調(diào)控元件對MEP途徑的這7個(gè)基因進(jìn)行調(diào)控，發(fā)現(xiàn)用適當(dāng)強(qiáng)度的調(diào)控元件對dxr、ispG和ispH基因進(jìn)行調(diào)控后，也能夠提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量(分別提高了40%、20%和20%)。另外，我們調(diào)控 dxs、ispDF、ispE和 idi這 4個(gè)基因，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的幅度比用T5的更大，分別提高了 250%、40%、40%和 110%。除此之外，我們還首次對ispA基因進(jìn)行調(diào)控，發(fā)現(xiàn)其使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了130%，表明該酶可能也是萜類化合物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵限速步驟。本研究的結(jié)果表明使用多個(gè)不同強(qiáng)度的調(diào)控元件對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控比僅使用強(qiáng)啟動子調(diào)控更為有效。

圖7 調(diào)控萜類合成途徑基因后β-胡蘿卜素的相對產(chǎn)量 (和野生型大腸桿菌MG1655相比較)Fig. 7 Relative β-carotene production after modulating isoprenoid gene expression, which was compared with the wild type E. coli MG1655. All strains were transformed with pACYC184-M-crt.

2.5 組合調(diào)控萜類合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)來提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量

通過利用不同調(diào)控元件調(diào)控MEP途徑各基因，發(fā)現(xiàn)對dxs和idi基因調(diào)控后，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高最大，因此將idi基因調(diào)控效果最好的菌株idi-M1-37-FKF的FRT-km-FRT敲除，然后用M1-64和M1-37調(diào)控dxs基因，將得到菌株轉(zhuǎn)化pACYC184-M-crt后測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。對大腸桿菌MG1655進(jìn)行dxs和idi組合調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別比野生菌提高了 5.5倍和 8倍 (圖8和表3)。用HPLC測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株idi-M1-37-dxs-M1-37-FKF (pACYC184-M-crt)，產(chǎn)量為17.59 mg/g干重細(xì)胞。

Yuan等用T5啟動子對dxs、ispDF、ispB和idi這4個(gè)基因進(jìn)行組合調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了6.3倍，達(dá)到6 mg/g干重細(xì)胞[2]。Suh用強(qiáng)啟動子T5調(diào)控MEP途經(jīng)的關(guān)鍵基因dxs、idi、ispDF后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量比對照提高了4.5倍[8]。本研究使用多個(gè)不同強(qiáng)度的調(diào)控元件對dxs和 idi基因表達(dá)進(jìn)行組合調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了8倍，效果同樣比僅使用強(qiáng)啟動子調(diào)控更好。

圖8 組合調(diào)控dxs和idi基因后β-胡蘿卜素的相對產(chǎn)量 (和野生型大腸桿菌MG1655相比較)Fig. 8 Relative β-carotene production after combined modulation of dxs and idi gene expression, which was compared with the wild type E. coli MG1655. All strains were transformed with pACYC184-M-crt.

3 結(jié)論

本文將β-胡蘿卜素合成途徑導(dǎo)入大腸桿菌，并用多個(gè)調(diào)控元件對大腸桿菌MEP途徑的7個(gè)基因和 ispA基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，發(fā)現(xiàn) β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的幅度比使用T5強(qiáng)啟動子的效果要好。和以前報(bào)道不一樣的是，我們發(fā)現(xiàn)用適當(dāng)強(qiáng)度的調(diào)控元件對dxr、ispG和ispH基因進(jìn)行調(diào)控后，也能夠提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。另外，我們對dxs和idi基因進(jìn)行組合調(diào)控后，將β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了8倍，也比使用T5強(qiáng)啟動子的效果要好。結(jié)果表明使用多個(gè)不同強(qiáng)度的調(diào)控元件對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控比僅使用強(qiáng)啟動子調(diào)控更為有效，為使用基因表達(dá)調(diào)控優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)品合成途徑的效率提供了一種新的方案。

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