張 鳳，姜昊澄，陳香儒，馬 哲，于海玲，全哲山

（延邊大學1.醫(yī)學院機能學實驗中心，2.藥學院藥物化學教研室，吉林 延吉 133000）

抑郁癥以持續(xù)情緒低落和認知功能障礙為主要臨床特征，目前已成為世界第4大疾患，全世界抑郁癥患者已達2億多，成為“21世紀的流行病”。抑郁癥越來越困擾現(xiàn)代人的生活，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測到2020年，抑郁癥將成為世界第2大疾患，因此被稱為“精神病學中的感冒”。抑郁癥患者中約15%的人最終會以自殺結(jié)束生命，其自殺危險比健康人高出80倍，嚴重危害人類身心健康［1］。

目前臨床常用的抗抑郁藥只能緩解患者部分癥狀，且常伴有明顯的不良反應(yīng)。因此，研究、開發(fā)高效、低毒的抗抑郁藥具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，四唑類化合物因其與苯二氮受體結(jié)合而具有顯著的抗炎［2］、抗菌［3］，和抗高血壓的生物活性［4］，但其抗抑郁作用，至今尚未見報道。6－（4－氯苯氧基）－四唑并［5，1－a］酞嗪（Q808）（圖1），是由延邊大學藥學院合成的一種二氮雜萘四唑衍生物，在作者前期研究中證實其具有劑量依賴性抗癲癇作用，且高效（ED50＝6.8 mg·kg－1），低毒（TD50＝456.4 mg·kg－1）［5］，具有較大的開發(fā)潛力。本實驗通過小鼠懸尾實驗、強迫游泳實驗、腦組織單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）活性檢測、曠場實驗、利血平拮抗實驗，采用小鼠的不動時間、MAO活性、自發(fā)活動、上瞼下垂及低溫等行為學及生化指標，探討Q808的抗抑郁樣作用。

Fig.1 Chemical str ucture of 6－（4－chlorophenoxy）－tetrazolo［5，1－a］phthalazine（Q808）.

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

受試化合物 Q808，批號：20120201，純度99.68%，延邊大學藥學院提供；鹽酸丙米嗪，購自江蘇恩華藥業(yè)有限公司；氟西汀膠囊，購自上海西部藥業(yè)有限公司；羧甲纖維素鈉，購自沈陽化學試劑廠；Q808、丙米嗪及氟西汀均于實驗前用0.3%羧甲纖維素鈉配置成混懸液備用。利血平注射液購自廣東邦民藥業(yè)有限公司；單胺氧化酶試劑盒和蛋白含量測試盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物及分組

健康雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量20～24 g，清潔級動物，由延邊大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（吉2011－0007）。動物經(jīng)3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機分組，自由攝食和飲水，并維持室溫（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，每籠5只。行為學實驗于上午9：00－11：00，在安靜溫暖的環(huán)境中，各實驗組平行進行。

1.3 懸尾實驗

取70只雄性小鼠，實驗室適應(yīng)3 d后，進行懸尾實驗篩選，剔除不動時間不足20 s或超過160 s的小鼠，選取50只，按不動時間長短隨機分為正常對照組（0.3% 羧甲纖維素鈉，20 ml·kg－1，po），Q808 （5，10 and 20 mg·kg－1，po）， 丙 米 嗪（10 mg·kg－1，po）5組，每組10只；每天上午8：00給藥，連續(xù)7 d，每次po給藥前1 h禁食不禁水。第3次和第7次給藥后1 h進行懸尾實驗。實驗根據(jù)Ster u等［6－7］方法并略加改進。用醫(yī)用膠布將小鼠尾在距尾尖2c m處粘在一根水平木棍上，使動物分別倒掛于一盒子（30 c m×30 c m×25 c m，僅正前方呈15 c m×15 c m正方形開口，便于觀察）內(nèi)，以隔離動物視線，其頭部離盒子底面約5 c m。動物為克服不正常體位而掙扎活動，但活動一段時間后，出現(xiàn)間斷性不動，顯示失望狀態(tài)。觀察6 min，記錄后5 min內(nèi)的累計不動時間。

1.4 強迫游泳實驗及MAO活性檢測

另取70只雄性小鼠，實驗室適應(yīng)3 d后，進行強迫游泳實驗篩選，剔除不動時間不足10 s或超過150 s的小鼠，選取50只，按不動時間長短隨機分為5組。動物分組及給藥方法同上。第3次和第7次給藥后1 h進行強迫游泳實驗。實驗根據(jù)Porsolt等［8－9］方法并略加改進。小鼠分別置于一透明玻璃容器中〔高22 c m，直徑14 c m，水深10 c m，水溫（25±0.5）℃〕游泳6 min，累計后4 min內(nèi)小鼠在水中停止掙扎或者呈漂浮狀態(tài)，僅微小肢體運動以保持頭部浮在水面的持續(xù)時間（即不動時間）。每只動物更換一次水。

實驗結(jié)束后，動物立即脫頸處死，快速取腦，去除小腦部分，其余腦組織用4℃磷酸0.05 mol·L－1緩沖液（p H 7.8），制成10%組織勻漿液，3500×g離心10 min，上清液用于檢測MAO活性。根據(jù)試劑盒說明書要求，按順序加入相關(guān)試劑，混勻，連續(xù)抽提2 min，3500×g離心10 min，取上清液經(jīng)紫外分光光度計于波長242 n m處檢測吸光度值。勻漿液蛋白含量以考馬斯亮藍法檢測。

1.5 曠場實驗

取50只雄性小鼠，實驗室適應(yīng)3 d后，按體質(zhì)量隨機分為正常對照組（0.3%羧甲纖維素鈉，20 ml·kg－1，po），Q808（5，10 和 20 mg·kg－1，po），氟西汀（20 mg·kg－1，po）5組，每組10只；給藥方法同懸尾實驗。第7次給藥后1 h進行曠場實驗。曠場實驗用于評價動物的自發(fā)活動，包括水平活動、垂直活動和理毛等。曠場實驗根據(jù)Archer等［10－12］方法并略加改進。敞箱為不透明塑料容器（80 c m×60 c m×30 c m），底面被分成48個10 c m×10 c m方格。每只小鼠分別被置于敞箱的中心，使其自由探索。記錄動物在3 min內(nèi)穿越底面的格數(shù)（3爪以上跨入）為水平活動得分，直立次數(shù)（兩前肢離地1 c m以上）為垂直活動得分，和修飾（理毛）的次數(shù)。實驗在黑暗房間內(nèi)進行，容器正上方放置60 W的燈泡，發(fā)出黃光，置于敞箱中心上方1 m處。每只小鼠實驗后應(yīng)用乙醇將裝置清潔干凈。

1.6 利血平拮抗實驗

取50只雄性小鼠，實驗室適應(yīng)3 d后，按體質(zhì)量隨機分為模型對照組（0.3%羧甲纖維素鈉，20 ml·kg－1），Q808（5，10，20 mg·kg－1），丙米嗪（10 mg·kg－1）5組，每組10只；每天上午8：00 po給藥，連續(xù)7 d。第7次給藥后1 h各組均ip給予利血平4 mg·kg－1［13－15］。

1.6.1 眼瞼下垂觀察

小鼠ip給予利血平1 h后，將小鼠單個豎放5 s，觀察小鼠上瞼下垂程度。評分標準如下：全閉為4分，閉3／4為3分，閉1／2為2分，閉1／4為1分，全睜為0分。以每組小鼠的得分取平均值作為計量指標，進行統(tǒng)計學分析。

1.6.2 肛溫測量

末次po給藥前將電子體溫計探頭插入小鼠肛門內(nèi)，深度以溫度計探頭完全進入肛門為準，維持至少10 s，測量肛溫作為小鼠基礎(chǔ)體溫；ip給予利血平2，3和4 h后，分別測量小鼠肛溫，計算各組小鼠肛溫變化的差值，將各給藥組及模型對照組用藥前后肛溫變化的差值進行統(tǒng)計學分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Q808對小鼠不動時間的影響

表1結(jié)果顯示，在第3次給藥后，與正常對照組相比，Q80810和20 mg·kg－1組小鼠不動時間分別減少26%，29% （P＜0.05），而丙米嗪10 mg·kg－1組則減少42%（P＜0.001）；在第7次用藥后，Q808 5，10和20 mg·kg－1分別使不動時間減少24%，27%和35%（P＜0.05）而丙米嗪10 mg·kg－1則顯著減少28%（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of Q808 on i mmobility time in the tail suspension test（TST）in mice

2.2 Q808對小鼠不動時間及MAO活性的影響

2.2.1 Q808對FST小鼠不動時間的影響

表2結(jié)果顯示，在第3次用藥后，Q808 10和20 mg·kg－1分別使不動時間減少28%和29%（P＜0.05），而丙米嗪使不動時間減少27%（P＜0.05）；在第7次用藥后，Q808 5，10和20 mg·kg－1使不動時間分別減少25%，27%和30%（P＜0.05），丙米嗪減少不動時間27%（P＜0.05）。

2.2.2 Q808對FST小鼠腦組織MAO活性的影響

表3結(jié)果顯示，在FST中連續(xù)用藥7 d后，Q808 5，10，20 mg·kg－1和丙米嗪10 mg·kg－1對小鼠腦組織MAO活性均無明顯改變〔F（4，45）＝0.21，P＞0.05〕。

Tab.2 Effect of Q808 on immobility ti me in the forced swi mming test in mice

Tab.3 Effect of Q808 on monoamine oxidase（MAO）activity in the mice brain tissues

2.3 Q808對小鼠自發(fā)活動的影響

在連續(xù)用藥7次后，與正常對照組比較，Q808 5，10，20 mg·kg－1和氟西汀20 mg·kg－1均沒有明顯改變曠場實驗中小鼠的水平活動〔F（4，45）＝0.76，P＞0.05〕、垂直活動〔F（4，45）＝1.32，P＞0.05〕及修飾次數(shù)〔F（4，45）＝1.32，P＞0.05〕（圖2）；各組小鼠體質(zhì)量亦沒有明顯改變（數(shù)據(jù)未列出）。

2.4 Q808對利血平誘導小鼠上瞼下垂及體溫下降的拮抗作用

表4結(jié)果顯示，在連續(xù)用藥7次后，與模型對照組比較，Q808 20 mg·kg－1和丙米嗪10 mg·kg－1明顯拮抗利血平注射后1 h小鼠的上瞼下垂，拮抗率分別為55%（P＜0.05），60% （P＜0.05）。表5結(jié)果顯示，Q808 10，20 mg·kg－1在利血平注射的第2，3，4 h明顯減小利血平注射前后小鼠肛溫差值），拮抗小鼠的低溫狀態(tài)，Q808 10 mg·kg－1拮抗率分別為25%（P＜0.05）和27%（P＜0.01），28%（P＜0.05）；Q808 20 mg·kg－1拮抗率分別為32%（P＜0.01），33%（P＜0.01）和29%（P＜0.01）；丙米嗪10 mg·kg－1在利血平注射的第2，3 h拮抗率分別為29%（P＜0.05），28%（P＜0.05），而在4 h對小鼠的體溫降低的拮抗作用則明顯減弱21%，與正常對照組相當。

Fig.2 Effect of Q808 on cr ossing（A），rearing（B）and grooming（C）in the open field test in mice.See Tab.1 f or mouse treat ment.±s，n＝10.

Tab.4 Effect of Q808 on ptosis in mice

Tab.5 Effect of Q808 on rectal temperature of mice

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，小劑量Q808在亞急性用藥對懸尾實驗和強迫游泳實驗中的不動時間影響較小，而延長用藥時間則效果明顯；Q808起效時間較丙米嗪慢，但仍體現(xiàn)了良好的時間及劑量依從性。

在懸尾實驗和強迫游泳實驗中，某些精神活性藥物可能通過激發(fā)小鼠的運動活性而導致不動時間的縮短，產(chǎn)生假陽性的實驗結(jié)果。所以，本研究通過曠場實驗檢測小鼠應(yīng)用Q808后的自發(fā)活動的改變，以排除假陽性的結(jié)果。在給予Q808 5～20 mg·kg－1連續(xù)給予7 d后，各組小鼠的自發(fā)活動及體質(zhì)量均無明顯改變。從而提示在以上兩種行為絕望模型中觀察到的小鼠抗抑郁作用并非運動活性增加所致。

目前抑郁癥的發(fā)病機制尚不清楚，基于其發(fā)生的神經(jīng)生物學因素，相關(guān)的假說有幾種，其中以單胺假說為主。單胺假說認為大腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如5－羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺水平低下可誘發(fā)抑郁癥［16－17］。目前臨床使用最多的就是基于單胺假說的抗抑郁藥［18］。這些抗抑郁藥通過抑制突觸外單胺類遞質(zhì)的重吸收或抑制它們的降解來提高突觸外單胺類遞質(zhì)的濃度達到抗抑郁效果［19－20］。利血平模型可用于初步篩選抗抑郁藥［13－15］。利血平是一種囊泡再攝取抑制劑，它使單胺神經(jīng)遞質(zhì)留在囊泡外，易被MAO降解，從而使生物胺耗竭，引起行為和生理反應(yīng)［15］。大腦生物胺的耗竭，引起嚙齒類動物的上瞼下垂和體溫下降現(xiàn)象。某些抗抑郁藥、MAO抑制劑和中樞興奮藥，可對抗這些作用［14－15］。本研究用藥7d后發(fā)現(xiàn)，Q808的抗抑郁作用可能與增加突觸間隙中單胺類遞質(zhì)的濃度有關(guān)，但這卻不是唯一的機制。

MAO是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的一個重要的代謝酶。MAO抑制劑是一種傳統(tǒng)的抗抑郁藥物，通過抑制MAO活性，減少單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的降解，相對增加大腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，發(fā)揮抗抑郁作用［21－22］。本研究結(jié)果表明，Q808的抗抑郁作用機制雖然可能與增加突觸間隙中的單胺類遞質(zhì)有關(guān)，但此作用可能與抑制MAO活性而引起的單胺類遞質(zhì)代謝減少無關(guān)。通過本實驗結(jié)果雖然可以初步推測Q808的抗抑郁機制可能與影響單胺類遞質(zhì)的含量有關(guān)，但具體是通過影響單胺類遞質(zhì)的合成、重攝取或轉(zhuǎn)運的哪一或哪幾個環(huán)節(jié)卻尚未涉及，或其可能還通過影響單胺遞質(zhì)之外的機制產(chǎn)生作用也尚未可知。

以上結(jié)果證實Q808在行為絕望模型中具有與丙米嗪強度相似的抗抑郁作用，且呈現(xiàn)一定的時效、量效關(guān)系，其作用機制有待于進一步研究。

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