關(guān)為群，楊 賓，王瑜華

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建福州 350001;2.醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建師范大學(xué)激光與光電子技術(shù)研究所，福建福州 350007)

激光在口腔醫(yī)學(xué)中應(yīng)用已成為一個(gè)新的研究方向。早期有關(guān)激光治療牙周病的研究局限于利用激光的熱能效應(yīng)來(lái)殺滅牙周袋中的致病菌甚至改變菌叢的組成變化來(lái)達(dá)到治療目的［1］。激光的殺菌作用隨著功率的增大而增強(qiáng)，但對(duì)靶器官和鄰近組織、細(xì)胞損傷的可能性也隨之增大。低能量激光療法(lowlevel-laser therapy，LLLT)，是通過(guò)低能量激光作用于靶組織使其達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)能，促進(jìn)組織功能恢復(fù)的作用。臨床應(yīng)用中低能量激光波長(zhǎng)范圍大多在600～950 nm間，且輸出功率只有毫瓦級(jí)別，治療過(guò)程中不會(huì)對(duì)生物組織產(chǎn)生不可逆損傷。近幾年的研究表明:LLLT對(duì)多種細(xì)胞有增殖效應(yīng)［2-5］。牙周病治療的最終目的是通過(guò)刺激牙周膜中的前體細(xì)胞分化和再生，促進(jìn)新附著的形成。人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)作為一組具有多向分化潛能的細(xì)胞，其與牙周組織的修復(fù)再生密切相關(guān)。因此，本研究通過(guò)658 nm低能量激光照射體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞，觀察不同能量密度照射對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性及纖維連接蛋白合成的影響，旨在為低能量激光應(yīng)用于牙周治療提供理倫依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要器材和試劑

658nm 激光器(Newport，USA)，激光功率計(jì)(spectral407a)，L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(GIBCO，USA)，β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松(Sigma，USA)，抗人角蛋白抗體廣譜，抗人波形絲蛋白抗體(北京中杉)，噻唑藍(lán) (MTT，Amresco)，二甲基亞砜(DMSO，上海生工)，組織細(xì)胞裂解液(北京鼑國(guó)生物公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京鼑國(guó)生物公司)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成科技有限公司)，人纖維連接蛋白ELISA試劑盒(武漢博士德)。

1.2 方法

1.2.1 hPDLCs的培養(yǎng)及來(lái)源鑒定 經(jīng)患者本人或家長(zhǎng)同意，取12-19歲因正畸需要拔除的牙周健康前磨牙，采用改良組織塊法［6］在6孔板中培養(yǎng) hPDLCs。每3天換液一次。待組織塊周?chē)?xì)胞生長(zhǎng)密集時(shí)原孔消化后繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞匯合后傳代培養(yǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)第4代細(xì)胞進(jìn)行波形蛋白抗體、廣譜細(xì)胞角蛋白染色，PBS液作為空白對(duì)照組。取第3代人牙周膜細(xì)胞，以 1×105/mL密度接種至35 mm培養(yǎng)皿中，24 h后棄原培養(yǎng)液，用DMEM礦化誘導(dǎo)液(其中含 10%FBS，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/mL抗壞血酸，10 mol/L地塞米松)連續(xù)培養(yǎng)5周，鏡下見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)形成后，0.1%茜素紅染色，鏡下觀察染色情況。

1.2.2 細(xì)胞接種密度的選擇 取第五代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的hPDLCs，制備十種不同濃度的細(xì)胞懸液 (1.0×104個(gè)/mL，2.0×104個(gè)/mL，至 10 ×104個(gè)/mL)，每個(gè)細(xì)胞濃度對(duì)應(yīng)一個(gè)組，共分十組，依次加入96孔板中培養(yǎng)。每孔接種200μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，共接種3塊板。細(xì)胞接種后置5%CO2，100%濕度，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后用MTT法測(cè)定細(xì)胞的吸光度(OD值)。

1.2.3 激光照射方法及分組 將第5代hPDLCs按2×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，共接種9板。每板分空白組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白組為不含細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液，其余兩組接種細(xì)胞。每組重復(fù)6孔，每孔接種200μL。為阻擋激光散射對(duì)鄰近孔內(nèi)細(xì)胞的影響，相鄰孔間添加0.4%無(wú)菌臺(tái)盼藍(lán)染液。每塊采用658 nm激光器進(jìn)行照射。激光器輸出模式為連續(xù)模式，光纖直徑為400μm，光纖末端輸出功率調(diào)節(jié)為11 mW，光斑面積為0.34 cm2，實(shí)驗(yàn)組照射時(shí)間分別為69 s，138 s，對(duì)應(yīng)能量密度分別為1.86 J/cm2和 3.72 J/cm2，對(duì)照組不進(jìn)行激光照射，其余條件同實(shí)驗(yàn)組。激光照射通過(guò)96孔板板蓋照射并在暗室中進(jìn)行，室溫為28℃。

1.2.4 MTT法檢測(cè)hPDLCs增殖效應(yīng) 激光照射24 h，48 h，72 h后，分別取出相應(yīng)孔板，每孔加5 mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加 DMSO150μL，振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔細(xì)胞吸光度值(OD值)。

1.2.5 激光照射后hPDLCs堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定 分別在激光照射24 h，48 h，72 h后，按照ALP檢測(cè)試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)ALP活性及細(xì)胞總蛋白量，并計(jì)算單位蛋白含量的相對(duì)ALP活性。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)激光照射對(duì)hPDLCs中合成纖維連接蛋白 FN的影響 激光照射24 h，48 h，72 h后，按照不同組別收集細(xì)胞培養(yǎng)液至干凈EP管中，室溫下，3000 r/min，15 min，收集上清液，按照人纖維連接蛋白試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定，用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中FN含量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間差異用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

4～8天內(nèi)，hPDLCs可從組織塊周?chē)纬?，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞排列呈放射狀或漩渦狀，多為長(zhǎng)梭形或星形，胞體豐滿，胞漿均勻，核呈圓形或橢圓形(圖1)。細(xì)胞波形蛋白染色陽(yáng)性(圖2)，角蛋白染色陰性(圖3)，證明細(xì)胞來(lái)源于中胚層。hPDLCs礦化液誘導(dǎo)5周后，鏡下可見(jiàn)顆粒狀的不透明結(jié)節(jié)形成，呈片狀或?qū)訝?，茜素紅染色后呈深紅色(圖4)。

圖1 hPDLCs原代培養(yǎng) ×100Fig.1 Primary culture of hPDLCs ×100

2.2 hPDLCs接種密度生長(zhǎng)曲線

根據(jù)hPDLCs不同時(shí)間段細(xì)胞接種濃度同OD值折線圖(圖 5)，進(jìn)行線性趨勢(shì)分析，24 h，48 h，72 h細(xì)胞接種濃度在2.0×104/mL與6.0×104/mL之間同細(xì)胞OD值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.9762、0.9542、0.9621。由于本實(shí)驗(yàn)觀察周期較長(zhǎng)，故選擇最低細(xì)胞濃度2.0×104/mL作為合適的接種濃度。

圖2 波形蛋白呈陽(yáng)性SABC×100Fig.2 Vimentin postive stain of hPDLCs×100

圖3 角蛋白呈陰性SABC×100Fig.3 Keratin negative stain of hPDLCs immunnohistochemical SABC method×100

2.3 658 nm激光照射對(duì)hPDLCs增殖效應(yīng)影響

如表一所示:激光照射24 h后，實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組相比，OD值顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);照射48 h后，實(shí)驗(yàn)組OD值低于對(duì)照組，二者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);72 h后，實(shí)驗(yàn)OD值高于對(duì)照組，具有顯著差異(0.05);但不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖4 礦化結(jié)節(jié) 茜素紅染色 ×100Fig.4 Mineralize nodule of hPDLCs positive Alizarin red staining×100

圖5 hPDLCs增殖率同接種濃度及培養(yǎng)時(shí)間三者關(guān)系折線圖Fig.5 The line chart of hPDLCs proliferation rate relations with inoculation concentration and incubation time

表1 658 nm激光照射對(duì)hPDLCs增殖效應(yīng)的影響(OD 值，x±s，n=3)Tab.1 Influence of 658 nm laser irradiation on hPDLCs proliferation effect

2.4 658 nm激光照射hPDLCs對(duì)ALP活性影響

658 nm 激光照射 hPDLCs 24 h，48 h，72 h 后，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP含量以及細(xì)胞蛋白含量。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出每孔蛋白含量，計(jì)算出單位蛋白含量的相對(duì)ALP活性。

如表2所示:在同一培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，激光照射hPDLCss后，細(xì)胞分泌ALP含量增高，并且隨激光照射能量密度的增加而升高;但激光照射后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞分泌ALP含量未見(jiàn)明顯變化。

激光照射24 h，48 h，72 h 后，1.86 J/cm2組同相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，雖然細(xì)胞分泌ALP較對(duì)照組高，但二者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3.72 J/cm2組同相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，二者間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明3.72 J/cm2能顯著促進(jìn) hPDLCss分泌 ALP。激光照射24 h，48 h后，不同劑量照射組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但72 h后，二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 658 nm激光照射hPDLCs合成FN影響

如表3所示:激光照射hPDLCs 24 h后，培養(yǎng)液中FN含量未見(jiàn)增高，激光照射48 h和72 h后，照射組培養(yǎng)液中FN含量較對(duì)照組增高。但激光照射48 h后，同對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，僅在激光照射72 h后，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞上清液中FN含量高(P＜0.05)，但實(shí)驗(yàn)組組間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

表2 658 nm激光照射對(duì)hPDLCs分泌ALP的影響(OD 值，x± s，n=3)Tab.2 658 nm Laser irradiation effects on ALP hPDLCs secretion

表3 ELISA檢測(cè)658 nm激光照射對(duì)hPDLCs合成 FN 的影響(OD 值，x±s，n=3)Tab.3 658 nm Laser irradiation effects on hPDLCs synthesis of FN by ELISA

3 討論

MTT法是檢測(cè)細(xì)胞增殖的常見(jiàn)方法之一。本實(shí)驗(yàn)中96孔板每孔生長(zhǎng)面積有限，細(xì)胞接種濃度的多少同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)接種不同濃度的細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞接種濃度同OD值間的線性關(guān)系，確定合適的細(xì)胞接種濃度，以排除細(xì)胞接種濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。除此之外，激光在不同介質(zhì)中傳播時(shí)，能量損耗亦不同。本研究實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn):96孔板中培養(yǎng)液存在與否對(duì)激光能量損耗不產(chǎn)生影響，但由于溫差緣故，激光照射時(shí)96孔板板蓋內(nèi)表面會(huì)形成水霧，水霧的存在影響細(xì)胞實(shí)際接收的激光能量。因此，每次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均通過(guò)光功率計(jì)對(duì)細(xì)胞實(shí)際接受的激光功率進(jìn)行測(cè)量，保證每次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接收的能量相同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激光照射24 h后，照射組細(xì)胞增殖速度比對(duì)照組顯著加快，說(shuō)明658 nm激光照射促進(jìn)hPDLCs增殖，同以往文獻(xiàn)相符［7］。但是，激光照射48 h后，照射組細(xì)胞OD值較對(duì)照組減低，可能是由于細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)快而產(chǎn)生接觸抑制的緣故。因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中細(xì)胞接種濃度為 2.0×104cells/mL，較Kreisler M等實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞接種濃度要高，并且96孔板每孔生長(zhǎng)面積有限，激光照射后，hPDLCs快速生長(zhǎng)更容易發(fā)生接觸抑制。由于hPDLCs可以復(fù)層生長(zhǎng)，激光照射hPDLCs 96 h后，照射組細(xì)胞OD值高于對(duì)照組細(xì)胞，且照射組同對(duì)照組相比具有顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)從正反兩方面說(shuō)明激光能量密度為1.86 J/cm2和 3.72 J/cm2時(shí)，658 nm 激光照射能顯著促進(jìn)hPDLCs增殖，但不同能量密度照射組之間無(wú)明顯差異。

堿性磷酸酶是一種分布于細(xì)胞膜的鈣結(jié)合蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，其與礦物質(zhì)的形成改建密切相關(guān)，在礦化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。hPDLCs在礦化液誘導(dǎo)后形成礦化結(jié)節(jié)，說(shuō)明hPDLCs具有向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化的能力。本實(shí)驗(yàn)中，658 nm激光照射hPDLCs后，細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP活性較對(duì)照組增高，提示LLLT具有促進(jìn)hPDLCs中ALP活性表達(dá)，可能促進(jìn)其向成骨細(xì)胞的分化，這同Stein A 等人結(jié)果一致［8］。本實(shí)驗(yàn)表明，1.86 J/cm2能量密度能促進(jìn)hPDLCs分泌ALP，但同對(duì)照組相比，兩者無(wú)明顯差異，而能量密度為3.72 J/cm2的實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組間具有顯著差異。說(shuō)明hPDLCs只有在接受一定能量密度的激光照射才能促進(jìn)其分泌ALP。其可能原因是由于激光照射hPDLC作為一種物理刺激，只有在刺激強(qiáng)度達(dá)到閾值后才能產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)。其次，Moore P等指出LLLT的生物學(xué)刺激效應(yīng)同激光器的波長(zhǎng)有關(guān)［9］。

纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)作為細(xì)胞外基質(zhì)中粘附糖蛋白，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、分化過(guò)程有關(guān)。牙周新附著的形成在于牙周膜細(xì)胞較上皮細(xì)胞優(yōu)先占據(jù)根面以免上皮結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，能量密度為1.86 J/cm2時(shí)，658 nm激光照射能促進(jìn)hPDLCs分泌FN。Kim等［10］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明牙齒移動(dòng)過(guò)程中應(yīng)用低劑量的激光照射能促進(jìn)牙周組織中纖維連接蛋白和I型膠原蛋白的表達(dá)。我們實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，658 nm激光照射24 h，48 h后，hPDLCs分泌FN量未見(jiàn)明顯變化，72 h后較對(duì)照組明顯增高?？赡艿脑蚴羌す庹丈鋒PDLCs后，細(xì)胞合成FN并分泌到培養(yǎng)液中需要一定的時(shí)間才能完成。此外，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)658 nm激光在能量密度1.86 J/cm2時(shí)才能促進(jìn)細(xì)胞FN的合成。其可能原因是由于1.86 J/cm2能量密度的激光照射hPDLCs是一個(gè)強(qiáng)度適當(dāng)?shù)拇碳?，此時(shí)靶組織的生物效應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平臺(tái)期，此時(shí)接受更大的刺激也不會(huì)增強(qiáng)生物效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，658 nm低能量激光照射促進(jìn)hPDLCs增殖、ALP活性及FN合成，可能有助于牙周組織的再生和附著。但不同能量密度的激光照射對(duì)hPDLCs產(chǎn)生的生物效應(yīng)不同。提示LLLT應(yīng)用于臨床時(shí)，需要選定適當(dāng)?shù)募す鈪?shù)才能取得理想的療效，有待深入研究。

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